激光伤害的斑马鱼胚胎骨骼肌

Cécile Otten; Salim Abdelilah-Seyfried

doi:10.3791/4351

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摘要
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摘要

这里介绍的方法，包括精确的具有高能量的激光脉冲和随后的分析随时间的伤害和其恢复损伤的活斑马鱼胚胎。我们还展示了如何转基因标记的单或骨骼肌细胞可以被跟踪和激光损伤后。

摘要

不同的实验方法，使用鼠标的目的是研究肌肉再生，的包括myotoxin注射（布比卡因，心脏毒素或notexin），，，肌肉移植（神经损伤周围血管离断术诱导再生），大强度运动引起肌肉损伤，但也小鼠的肌营养不良症模型如评论这些方法mdx小鼠（参见图^1）。在斑马鱼基因的方法包括突变体，表现出肌营养不良症的表型（，如runzel ²或sapje ^3）和反义寡核苷酸吗啉代，阻止营养不良相关基因的表达。此外，化学方法，也有可能，例如，加兰他敏，一种化学化合物抑制乙酰胆碱酯酶，从而导致hypercontraction，最终导致肌营养不良症^5。然而，遗传学和药理学方法克enerally影响个人所有的肌肉内，而身体造成伤害的程度，更容易控制时间和空间上^1。本地化的人身伤害可以作为内部控制的评估对侧肌肉。事实上，我们最近用激光消融介导的细胞研究在斑马鱼胚胎⁶骨骼肌再生，而另一组最近报道了利用双光子激光（822 nm）的损害本地个别胚胎斑马鱼肌肉的细胞膜细胞^7。

在这里，我们报告使用微点激光（安道尔的技术）在斑马鱼胚胎骨骼肌细胞损伤的方法。微点激光是一种高能量的激光，这是适合于在波长为435nm的靶细胞消融。的激光以这样的方式被连接到显微镜（在我们的设置，光学显微镜从蔡司）显微镜，可以使用在同一时间f或聚焦在样品上的激光和用于可视化的伤人（明或荧光）的影响。用于控制激光脉冲的参数包括波长，强度和脉冲数。

由于其透明度和外部的胚胎发育，斑马鱼胚胎的研究为激光损伤和随后的复苏是非常适合的。受精后1至2天，体节骨骼肌细胞逐渐接受由前向后成熟体节发育的进展，从树干尾^8，9。在这些阶段，胚胎自发地抽搐，并开始游泳。最近斑马鱼已被确认为一个重要的脊椎动物模式生物组织再生的研究，许多类型的组织（心脏，神经，血管等）损伤的成年斑马鱼^10，11后是可以再生的。

研究方案

1。单细胞进行标记

注入单细胞阶段的胚胎的质粒编码GFP或任何GFP融合蛋白的β-肌动蛋白启动子的控制下。在开发过程中，GFP的表达，在时尚的马赛克。这里，我们使用的转基因构建体的Tg []，放置的α-辅肌动蛋白-GFP融合蛋白的β-肌动蛋白启动子的控制下的β-肌动蛋白：α-辅肌动蛋白-GFP。

2。胚胎嵌入

收藏报错斑马鱼胚胎中，并保持在正常条件下，直到28高倍视野（分段根据^12）。
Dechorionate胚胎体视显微镜下，用镊子（杜蒙＃5）。
准备在显微镜载片用凡士林环。
准备1％低熔点琼脂糖/在10毫升10％的三卡因溶液与E3介质：煮沸100毫克琼脂糖E3溶液，得到的液体和均匀的琼脂糖溶液;等分和存储未使用的琼脂糖溶液，在-20℃下以供进一步使用。立即使用，让煮熟的解决方案冷静下来，保持在最大。 39°C。添加三卡因库存中的溶液中，得到的最终浓度为10％的三卡因。三卡因和琼脂糖均是必要的，以防止胚胎的变动。
嵌入单个胚胎在1％低熔点琼脂糖/ 10％三卡因/ E3介质凡士林环内，与胚胎铺设自然的一侧，轻轻用盖玻片覆盖，只是为了保持胚胎到位并避免凸这将打破光的表面。理想的情况下，将有针对性的胚胎肌肉组织的触摸盖玻片。

3。胚胎激光伤人

准备微点激光和显微镜：
1. 如何设置和使用的激光显微镜结合的详细说明，请参阅微点激光手册。
2. 选择正确的染料的435纳米波长的激光束的产生。
3. 调整激光功率，通过使用衰减滑块。激光功率足够强大，打破了玻璃表面的单脉冲（例如对焦的样本，以测试此盖玻片）。这是细胞消融所需的激光功率。
专注于感兴趣的使用安装在显微镜的目镜的分划板的区域或小区。使用20倍的物镜（40倍，将允许更精确的损害，但往往此透镜的工作距离是不够的）。

注1：激光不仅会损伤细胞的聚焦平面内，而且细胞的上方和下方激光束内。确保激光最佳地设定和调整内的z-轴的最大焦点的实验之前。最好是确定的激光损伤的深度进行实验之前，为了知道哪个小区极可能会受伤。

设置的可视化的实验所需要的光：明场正常使用，或荧光如果目标是荧光标记的细胞。
寄脉冲的激光的目标区域，或多个脉冲，这取决于所期望的程度的损伤。

4。伤人及恢复分析

如果需要，该程序可以被记录的激光损伤活（ 例如，使用Metamorph软件流采集选项）。
伤人后，立即被删除的胚胎从琼脂糖轻轻用钳子放回蛋水的恢复。

注2：肌肉活动（游泳和抽搐）是特别重要的是骨骼肌肉的恢复。由于胚胎不能移动，因为三卡因曝光和僵硬琼脂糖嵌入，它不是recommended，以维持胚胎幻灯片和盖玻片之间的时间过长。

恢复后，可以固定的，胚胎，分析所需的通过光，荧光或共聚焦显微镜。