RNA-seq的凝血酶处理和控制人肺微血管内皮细胞的转录组分析

Dilyara Cheranova; Margaret Gibson; Suman Chaudhary; Li Qin Zhang; Daniel P. Heruth; Dmitry N. Grigoryev; Shui Qing Ye

doi:10.3791/4393

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摘要

该协议提供了一个完整而详细的程序，申请一个功能强大的下一代DNA测序技术，RNA-seq技术，在人肺微血管内皮细胞或无凝血酶治疗的个人资料转录。这个协议是一般化到各种细胞或组织中的影响不同的试剂或疾病状态。

摘要

通过测量细胞中的mRNA水平的基因表达的特征是确定如何转录机制的细胞受到外部信号（如药物治疗），或不同的细胞如何健康状态和疾病状态之间的一个有用的工具。随着新一代DNA测序技术的出现和不断改进，RNA测序（RNA-seq的）已成为越来越受欢迎的转录组分析的方法进行编目所有种类的成绩单，以确定所有基因表达的转录结构和量化的表达水平的变化在一个给定的细胞，组织或生物体^1,2的总组转录。 RNA-Seq是逐渐取代DNA微阵列转录组分析的首选方法，因为它有一个完整的转录组分析的优势，提供一个数字型数据（拷贝数的任何誊本），而不是依靠任何已知的基因组sequenCE ^3。

在这里，我们提出了一个完整的，详细的协议，适用个人资料转录RNA-seq的人肺微血管内皮细胞或无凝血酶治疗。该协议是基于我们最近发表的研究报告，题为“RNA-seq的揭示新型转录的基因及其亚型在人肺微血管内皮细胞凝血酶治疗^，”4中，我们成功地完成了第一个完整的人肺微血管内皮细胞的转录组分析与凝血酶使用RNA-seq的治疗。进一步的实验，取得了前所未有的资源，获得洞察的分子机制，凝血酶介导的内皮功能紊乱的炎症性疾病，癌症，糖尿病和冠状动脉心脏疾病的发病机制，并为这些疾病的治疗目标，以提供潜在的新的线索。

此协议的描述性文本被分成四个部分。第一部分介绍了人肺微血管内皮细胞的凝血酶和RNA的提取，质量分析和定量分析的治疗。第二部分介绍了图书馆的建设和测序。第三部分描述了数据分析。第四部分描述的RT-PCR验证试验。显示了有代表性的几个关键步骤的结果。在讨论中提供有用的提示或预防措施，以提高成功的关键步骤。虽然该协议使用人肺微血管内皮细胞用凝血酶，它可以是广义在哺乳动物和非哺乳动物的细胞和组织中具有不同刺激物或抑制剂，或在细胞或组织之间的健康状态来比较转录处理的档案中转录和疾病状态。

研究方案

概述本协议的流程图显示在图1。

1。处理过的细胞凝血酶，总RNA的提取，质量评价和定量RNA

培养人肺微血管内皮细胞（HMVEC-LBL）90-100％汇合在EGM-2培养基的6孔板中，5％FBS，生长因子和抗生素（龙沙，猫＃CC-3202）。
变更媒体饥饿媒体（0％FBS）30分钟前，用凝血酶处理。
治疗的细胞用0.05 U / ml凝血酶或留下未处理的作为控制6小时，在37℃和5％CO _2。
根据制造商的说明使用Ambion公司的的MIR瓦纳套件组和对照组的细胞，提取总RNA。
根据标准协议，在Experion的全自动电泳站（评估质量的RNA与的Experion StdSense真核RNA芯片的=“_blank”>生物技术有限公司www.bio-rad.com）。
量化的RNA，使用标准的分光光度测定方法。

2。图书馆的建设和测序

使用高品质的每个样品的总RNA作为起始原料的1微克。
要构建库，按照标准的程序，从Illumina公司（协议＃15008136修订版A）。在这个协议中，两回合的poly（A）含有基因的选择进行删除rRNA基因，以尽量减少rRNA序列。
评估质量的图书馆使用的Experion DNA 1K芯片根据协议在Experion自动电泳站（生物技术有限公司www.bio-rad.com ）的标准。
使用定量PCR量化库：使用一个库，先前已被测序的标准曲线和特异性引物的连接适配器。未知的库（即 1:100，1:500和1:1000）稀释的使用范围。运行的qPCR ACCO富于到的SyberGreen的MM协议，并计算每个库的原始股票的浓度。
10纳米和储存在-20°C，直到准备群集流动池稀释库股票。
在准备群集流动池，在水浴中解冻CBOT试剂板。 CBOT是一个Illumina公司的仪器，用于简化集群生成过程。
洗芝加哥期货交易所的仪器。
变性图书馆：联合13微升1×TE和6μl10μM的库，侧管，加入1微升的1 N NaOH（Illumina公司提供）。漩涡，旋转，室温孵育5分钟，放置在冰的变性库。
稀释库：用预先冷却的杂交缓冲液中稀释的变性图书馆（HT1，Illumina公司提供）由结合下午12点的最终浓度为996微升HT1和4微升变性库。将冰的变性及摊薄库。
反转每一行的CBOT板，管，确保所有试剂融化。自旋向下的板块，删除/穿刺的铝箔密封件，并加载到芝加哥期货交易所。
等分的120微升稀释的，变性的图书馆的带状管，标记为1-8。每管加入1.2μl稀释，变性PhiX控制库（Illumina公司）有穗的控制。涡街流量计和旋管，并加载它们在正确的方向芝加哥期货交易所（管＃1在右边）。
到芝加哥期货交易所加载的流动池和歧管。
完成流量检查，并开始运行的集群。
运行完成后，检查试剂提供的所有车道。请注意任何异常。无论是立即开始测序运行流动池或存储在所提供的管，在4℃下
解冻合成边测序（SBS，Illumina公司）试剂。
装入试剂的试剂盘到适当的位置，确保不要接触到其他试剂接触后的切割组合。
使用无N-测序流通池（即一个被测序），两次总理的试剂管线。
彻底清洁序流通池，用70％的乙醇和Kimwipes，其次是70％的乙醇和镜头纸。检查任何条纹的流动池。重新必要时进行清理。
加载到定序器的流动池，执行流量检查，以确保歧管之间的密封和流动池是紧。
启动的顺序运行。
评估，因为他们成为可用在运行过程中的质量指标（如群密度，通过过滤器的集群，Q30，强度）。
监视整个运行强度。
101周期完成后，执行完成第二次读取周转化学：解冻的的配对末端试剂和第二个读法团缓冲器（ICB，SBS试剂的一个组成部分，Illumina公司）和加载的试剂。
继续测序运行，评估^第二次读强度，Q30一在运行过程中的第二等质量指标。

3。数据分析

使用最新版本的CASAVA（Illumina公司，目前为1.8.2）转换基地调用文件（BCL）文件。fastq文件，fastq簇数为0，以确保每个样品的一个单一的fastq文件的创建。用于下游分析解压缩的fastq的文件。
执行成对的末端对齐使用最新版本的顶帽^{（1.4.1）5，}对齐RNA-seq的读取大小的哺乳动物基因组的超高通量短读定位器（蝴蝶结^{，0.12.7）6}和SAMtools（0.1。 ^17）7。 SAMtools实现各种工具，用于处理后的SAM格式的结盟。参照人类转录组，可以下载从iGenomes（ www.illumina.com ）。在运行的顶帽，我们使用默认的参数设置，包括库类型“选项（默认）FR-unstranded。
我们⁸软件包ING方案CuffDiff的，部分的袖扣（1.3.0），比较凝血酶处理的细胞的控制细胞，筛选出的差异表达的基因转录在前者基于人类基准转录。这种比较检测到的差异表达已知的成绩单。使用Microsoft Excel的可视化结果以表格的形式。在运行袖扣程序，我们使用默认参数设置。这些基因的转录与FPKM <0.05和P> 0.05被过滤掉。
检测新亚型，运行袖扣无参考转录。比较样本抄本文件的参考基因组Cuffcompare，用合成凝血酶抄本文件作为一个分析和综合控制的参考基因组转录文件作为参考基因组的第二个分析测试的差异表达Cuffdiff，。使用Microsoft Excel在表格的形式来显示结果。同样，茨艾伦E基因转录与FPKM <0.05和P> 0.05被过滤掉。在这一步之后，研究人员可以选择上传一个新报告的成绩单列表的UCSC基因组浏览器网页（ http://genome.ucsc.edu/ ），通过手动检查以验证其有效性。
提交列表中差异表达的基因，以别出心裁的途径分析（IPA， www.ingenuity.com ）为特征的凝血酶治疗的基因和通路的影响。在这个步骤中，调查人员可以选择使用腰带（ http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ）的R套件，旨在帮助和简化的任务分析袖扣RNA-seq的输出，来帮助管理，可视化和整合生产的Cuffdiff分析所有的数据。

4。验证RNA-seq的结果实时定量宝lymerase链反应（定量RT-PCR）

执行提取总RNA控制的凝血酶治疗的HMVEC的-LBL细胞中，RNA质量评估和RNA定量描述的步骤1.4至1.6。
产生互补DNA来自1微克的总RNA，每个样品的SuperScript III第一链合成系统的RT试剂盒，按照制造商的说明（Invitrogen公司制，18080-051）。
一个美国应用生物系统公司VIIA 7实时PCR系统，利用TaqMan分析的需求设计的寡核苷酸检测CUGBP，ELAV likefamilymember1（CELF1，Hs00198069_m1），Fanconianemia，complementationgroupD2（FANDCD2，Hs00276992_m1），TNFreceptor进行定量RT-PCR分析相关因子1（TRAF1，Hs01090170_m1），和β-肌动蛋白（ACTB，Hs99999903_m1）。每个样品有一个相当于5 ng总RNA的模板。测量定量使用DDCT方法和规范，以β-肌动蛋白。每个试验进行过至少3次生物学重复。