质量流式细胞术：协议，每日调整和执行细胞的样品上一个CyTOF的质量流式细胞仪

摘要

日常调整和优化的性能的CyTOF质量流式细胞仪所必需的步骤说明。上最佳的样品制备和流速的评论讨论

摘要

在最近几年中，单个细胞的快速分析通常被执行采用流式细胞仪和荧光标记的抗体。但是，这个问题限制了数量的同时探针的荧光光谱重叠排放。相反，新的CyTOF质量流式细胞仪由DVS科学夫妇液体单细胞引入系统的ICP-MS ¹而不是荧光，螯合聚合物含有高度富集的金属同位素被连接到抗体或其它特异性探针^。2-5由于金属的纯度和质量分辨率的流式细胞仪的质量，有没有“光谱重叠”从相邻的同位素，因此，没有必要的补偿矩阵。此外，由于使用的镧系金属，有没有生物的背景，因此没有等效的自发荧光。有了一个质量窗口跨越原子质量103-203，理论上可达100个标签同时可以区分。目前，35个以上的信道可使用的螯合试剂可从DVS科学允许前所未有的夹层的免疫学的档案样本^6-7

大规模流式细胞术的缺点包括每一个单独的金属同位素探针（没有相当于向前或侧向散射光），和事实，即它是一种破坏性技术（没有分拣恢复的可能性）的严格要求。流式细胞仪的质量的当前配置，还具有的小区传输率只有〜25％，因此需要较高的输入的细胞数。

日优化性能的质量仪需要几个步骤。优化的基本目标是最大化所需金属同位素（M）的所测量的信号强度，而形成的氧化物（M 16），将减少与任何所需的信号，在M 16的M信号强度和干扰最小化。第一步是热身机器，使一热，稳定的ICP血浆已经建立。其次，电流和补充气体流率的设置，必须在每日的基础上进行了优化。在样品的采集，最大细胞事件发生率是由检测器的效率和1000个细胞/秒的处理速度的限制。然而，根据较慢的细胞事件的发生率（300-500个细胞/秒）上的样品的质量，通常是可取的，以允许更好的分辨率细胞之间发生的事件，从而最大限度地提高对双峰和碎片完好汗衫。最后，足够的清洗的机器在一天结束时，可以尽量减少背景信号由于游离金属。

研究方案

所有细胞为CyTOF样本必须固定和透化。这使得更大的含铱的DNA嵌入条目，并且还可以防止细胞裂解过程中的MilliQ水洗涤和再悬浮步骤之前立即注入流式细胞仪的质量。

1。启动的群众，流式细胞仪

1. 打开CyTOF的软件程序。选择仪器设置。在卡箱“选项卡，进入到右下角，然后单击”加热器“ON”按钮。打开加热器至少15分钟之前所需的时间，以便有足够的时间的雾化室地幔的达到200°C。
2. 更换白色规范项目3毫升注射器充满MilliQ水的一个新的注射器注射泵。
3. 清洗喷雾器。反冲通过使用注射器和油管拉5％citranox，两个较小的液体导入口和较大的气体导入口的2-3倍，通过雾化器。重复反冲用MilliQ水tØ去除残留的citranox。
4. 检查确认前的CyTOF面板上的灯被点亮，如在图1中。

图1。CyTOF面板灯之前启动。

5. 打开氩气罐的阀门。这应该引起“氩”光的前面打开。
6. 将雾化器，使气体入口。拧下使气体管道连接器，黑色橡胶O型圈，白色锥形塑料片拆下。注意更广泛的“转向节”雾化器上的气体导入口干。放置在连接器上的气体导入口。黑色的O形圈放置在进气口端部的，和过去的较宽部分的端口干强制的O形环。将顶部的窄端的白色圆锥形塑料片上指出，和螺杆化妆气体管道上。
7. RFG控制器“选项卡的”仪器设置“窗口中，按下”开始“等离子”。由于雾化器已经插入，然后按“OK”。软件会打开冷水机组，启动气体的流量，并点燃了等离子。该探测器电压会上升。将有一个弹出式窗口，说：“等离子的启动顺序已成功完成”完成后，按“OK”。新的灯应该是在前面板上（ 图2 >）。

图2。CyTOF面板灯等离子点燃后，启动成功完成。

9. 注射器泵的开启。在右上角，按绿色的“播放”按钮开始注射泵，并开始流动的液体通过管道和雾化器喷射而出。默认的注射器设置为3毫升水。为了样品流经样品定量环，注射泵必须定期更换的，当它运行的水。在屏幕的顶部，是一个计数器，其指示多少液体流出的注射器泵。当此计数器达到“3.000”或柱塞击中的注射器的端部时，将停止的注射器泵。当重新填充注射器，你必须打“停止”，而不是蓝色的“暂停”按钮，重设计数器。

E“> 2。每日的群众流式细胞仪的校准

1. 流式细胞仪的质量大约需要20分钟，以达到校准前的一个热点，稳定的等离子体。的调整步骤的目的是最大化，同时保持所需的信号Tm169或Tb159“Gd155”（氧化物La139 + O16）信号在3％以下价值较高。点击获取设置“按钮，打开数据采集设置”窗口中。在分析物“选项卡上，单击”周期表打开的同位素选择面板。选择DVS科学调优解决方案手册中列出的同位素，然后单击“保存”。
2. 点击阅读按钮，每次读取窗口打开大容量（ES）的同位素每。进入一个新的号码，然后按“ENTER”选择“脉冲计数”，重新调整y轴。
3. 填写一个绿1毫升注射器与规范项目调整解决方案。打开的的样品端口选择“LOAD”，注入450μl的调优解决方案，然后旋转选择器“注入”。在质量校正“选项卡上的数据Acquisit中离子设置“窗口，按”运行“监控群众都流淌着。窗口的左侧是较低的质量，而右侧是较高的质量。注意：将已经在TOF 9400-9800区域的信号，由于氩气中的（ 图3）的氙同位素。等待，直到调优解决方案同位素开始出现条纹，这显示（ 图4）。

图3。质量校正“选项卡窗口，显示各种同位素的背景水平后，洗涤液和清水冲洗。 9400-9800 TOF周围区域对应的氙同位素氩气中的，总应该存在。 点击此处查看大图 。

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图4。质量校正“选项卡窗口，显示垂直条纹各种同位素DVS调优解决方案。 点击此处查看大图 。

4. 返回的质量（）每次读取的窗口，按下绿色的“播放”按钮，在左上角。在步骤2.1中选择的每个同位素是由不同颜色的线表示。默认的X轴是“时间”，以秒为单位。监视水平的不同的同位素，直到他们是稳定的。
5. 调谐电流。在“参数”选项卡的数据采集设置“窗口中，从下拉菜单中选择”当前“。让我们开始= 0，完成= 10，步长值= 0.5，沉淀时间= 200，然后按“保存”。点击返回每次读取的窗口和打比赛的质量（ES）。的x-轴的现在是“当前”。记下的信号的同位素峰（ 图5），和r ECORD。在DAC通道设置“选项卡的”仪器设置“窗口中，向下滚动到”当前“，然后输入这个新的价值。按“实际电流值”，然后单击“保存”。

图5。电流调节配置文件。

6. 调整的化妆气体。更改下拉菜单中的“化妆气。”让我们开始= 0.55，= 0.95，步长值= 0.05，稳定时间= 200结束。按保存。每次读取的窗口和打比赛的质量（ES）。 x轴是现在“化妆气体”的流量。记录下的信号的同位素峰。观察的“Gd155”附近的端部的信号（ 图6）的快速增加。返回的DAC通道设置“选项卡，向下滚动到”化妆气“，进入这个新的价值。按“实际电流值”，然后单击“保存”。

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图6。化妆气体调节配置文件。

7. 记录率所需的同位素比氧化物。第二个450微升注射调优解决方案。在“参数”选项卡上，从下拉菜单中选择“时间”，让我们开始= 0，最终解决时间= 200 = 10，步长值= 1，。按“保存”。每次读取的窗口，按下“播放”质量​​（ES）。行后已稳定（ 图7），使用光标阅读的价值在左上角方块（数值越高，Tm169或Tb159）和“Gd155”价值较高的值（<3％）。这些值也被保存在一个调谐文件以供将来参考。

图7。优化后的电流和化妆的气调优解决方案的信号强度测量。

8. 清洗样品PLE循环。注入3毫升的MilliQ水通过进样环DVS的洗涤液，随后加入500μl。监控进度的清洗，按“运行”，在“质量校准”选项卡。洗净直到条纹的强度（ 图4）开始减小，然后按照由3毫升的MilliQ水和显示器，直到下降到背景水平（ 图3）。

3。运行样品

1. 打开采集窗口。默认设置：做[分析=-THE-FLY，信号分析=双，双计校准数据。降噪选择。如果需要的话，可以改变任何这些。输入文件名。 必须将所有文件保存到E :/ /驱动器。
2. 设置采集的延误。注册细胞的的样品循环和雾化器之间的管道的长度约30秒的事件，由于会有轻微的延迟。因此，“采集延迟”的总和和“探测器第一能力延迟“应该是至少30秒。探测器稳定性延迟应该是至少20秒。
3. 设置收集数据的时间。 “采集时间”是你要运行您的样品的秒数。填充整个450微升样品环，将需要600秒才能完成。建议，50-100秒被添加到运行时间的结束，以尽量减少样品结转。
4. 再悬浮的样品。为了尽量减少积聚在本机中的盐，它被认为至少两个做在MilliQ水中洗涤结束时的细胞染色，然后由一个最后的再悬浮在MilliQ水中。 MilliQ水的体积用重悬细胞沉淀将取决于您开始使用的细胞和细胞后恢复整个染色过程的数目而有所不同。一个很好的起点为10 ⁶细胞/ ml（启动）。再悬浮后，通过细胞过滤器过滤，以除去聚集。
5. 启动示范运行。当前样本输入新的文件名。样品循环阀切换到“LOAD”，注入样品，切换到“插入”，然后点击“运行”，在采集窗口。
6. 注册细胞的活动。将出席在细胞水平的标记同位素/标记在每个垂直通道（ 图8）集合的快照窗口。流式细胞仪的质量可以注册1000个细胞/秒，细胞活动之间的更好的分辨率通常在300〜500个细胞/秒。这相当于平均〜1细胞/屏幕刷新。它可能需要长达30秒前的细胞事件计数器开始攀升。这是由于“飞”数据处理;失去任何细胞事件信息。

图8在样品采集窗口运行，示出了三个单独的细胞事件关联的元素相对应的斑点的水平行。ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。

7. 细胞活动的质量。请注意，任何的背景裸奔在每个同位素通道，以及细胞事件发生率。流式细胞仪的质量承认“电池事件”在上述背景下的信号有一定的增加，使游离的金属或者未结合的抗体可以改变的“电池事件”计数的背景信号。此外，运行在过高的浓度的细胞可能会导致双峰的事件的数目的增加。背景可以减少额外的清洗或更大的细胞稀释。双峰更大的细胞稀释液，在运行时增加的成本可以最小化。
8. 完成采样数据采集。当采集时间已经达到，数据采集完成。会有点延迟，前一个弹出式窗口的“确定”按钮;再次，这是由于“飞行”数据处理。样品采集也可以停止普利马特urely通过点击“停止”按钮。在这种情况下，所有的细胞已经注册的事件将被计算和处理到输出文件中。
9. 至少500μL的MilliQ水之间每个样品注射也有助于最大限度地减少样品交叉污染。

4。使用后清洗机

1. 洗净的解决方案。在最后的运行样品和样品循环用水冲洗，洗涤液注入450μL的样品环。监控释放游离的金属中的的质量校准“选项卡的数据采集设置”窗口，在步骤2.8（ 图9）。当游离金属信号开始下降，用3毫升的MilliQ水冲洗和监测，直到达到背景水平。

图9。质量校正“选项卡窗口，在运行后DVS洗涤液清洗。垂直条纹TOF地区9800-11000抗体标记同位素被清理出来的机器。 TOF 11500左右的垂直条纹对应的两个红外嵌入同位素。 点击此处查看大图 。

5。关闭机器

1. 在的RFG控制器“选项卡”仪器设置“窗口中，选择”停止等离子“。当程序完成后，将有一个弹出式窗口，询问您删除雾化器。按“OK”。在卡箱“选项卡上，关闭加热器。关闭阀门的氩气供应。
2. 去除雾化器。将雾化器雾化室，仔细地拉向后。从步骤1.6拧下的样品引入管和放置一旁。拧开化妆的气体导入连接稍微放松，然后将雾化器。离开接头拧在了一起，将减少的机会升osing的黑色橡胶O型圈和白色锥形塑料片。
3. 清洗喷雾器。使用注射器和油管在步骤1.3中，用5％citranox反冲的雾化器的两个端口。商店，覆盖直到下次使用在5％citranox的。

结果

上述协议应做到四件事。首先，使足够的预热时间为流式细胞仪的质量会产生热，所需的最佳的信号和最小的氧化物形成的稳定的等离子体。二，流式细胞仪的质量，充分洗涤的MilliQ水和DVS的洗涤液（ 图9）将有助于减少吸附金属管和其他地区的机器的水平，有助于降低背景样品采集过程中（ 图8）。这也将有助于消除任何细胞，可能会卡在机器中，从而尽量减少残留样?...

讨论

在过去的几十年里，荧光流式细胞仪分析单个细胞的主力的方法，无论是在表面的表达和功能分析。然而，问题的荧光染料的光谱重叠的同步标记的数量有限制。虽然已有报道，实验中使用12个以上的同时标记所需的补偿量，使得此技术上有困难。

相反的荧光，质量仪率先由DVS科学使用螯合网站的聚合物的金属标签的抗体^。1-3由于纯度的金属和ICP-MS质量分辨率，没有?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论
CyTOF TM质量仪	DVS科学
洗涤液	DVS科学	201071	在水中的0.05％的氢氟酸
调优解决方案	DVS科学	201072	0.5 ppm的镧，铯，铽，铥，铱，微量硝酸
含Eu的聚苯乙烯珠	DVS科学	201073	包含欧盟自然丰度同位素，珠子提供在约100万个/毫升
多含稀土的（La /公关/ TB / TM /卢） - 聚苯乙烯珠粒	DVS科学	尚未市售	包含上市镧系元素的自然丰度同位素
硝酸（浓）	Fisher Scientific则	A467-500	越痕量金属的纯ICP-MS级
聚苯乙烯圆底管细胞滤网盖-5ML	BD	352235	用于过滤细胞样本，注射前
规范项目tuberkulin注射器1毫升	亨克萨斯狼	4010-200V0	无硅，无乳胶
规范项目注射器3毫升	亨克萨斯狼	4010.000V0	无硅，无乳胶
MilliQ水			18MΩ纯水;必须不被存储在已用商业洗涤剂（由于其高的水平存在的钡）的玻璃或塑料瓶。
企业所得税康闳	Sigma-Aldrich公司	Z273236	酸性清洁剂
氩气	普莱克斯	AR 5.0UH-T	超高纯度99.999％