体外实时成像在小鼠神经上皮单细胞分裂

摘要

在这里，我们开发所需的工具体外实时成像跟踪单E8.5的小鼠神经上皮细胞分裂

摘要

我们开发了一个系统，集成了实时成像的荧光标记物和小鼠胚胎神经上皮的培养切片。我们利用现有的鼠标线的遗传细胞谱系追踪：他莫昔芬诱导的Cre线和红色荧光蛋白的酶Cre记者表达Cre重组酶介导的重组后。通过使用他莫昔芬的相对较低的水平，我们能够在一个小数量的细胞以诱导重组，允许我们按照个别的细胞分裂。此外，我们观察到的转录反应刺猬（SHH）信号使用OLIG2-EGFP转基因株系^1-3，我们监测纤毛的形成与病毒感染培养的片表达的纤毛标记，SSTR3-GFP ^4。为了图像的神经上皮，我们收获胚胎E8.5，分离出神经管，安装在适当的培养条件下成神经切片成像室和执行时间推移共聚焦成像。我们的前活体内成像方法，使我们能够跟踪单细胞分裂，初级纤毛的形成和Shh响应有关生理的方式评估的相对时序。这种方法可以很容易地适应用不同的荧光标记物，并提供该字段，用以监测细胞行为的原产地和实时的工具。

研究方案

成年小鼠安乐死机械颈椎脱位。所有动物的程序批准由IACUC和埃默里大学生物安全委员会。

1。胚胎生成

1. 过他莫昔芬诱导表达Cre重组酶行CAGGCreER，dsRedCre记者线（玻璃转化温度（CAG-BGEO的，红色荧光蛋白* MST）1Nagy）（ 图^1）5,6。要监视的Shh的响应中的子细胞，跨CAGGCreER和DsRed的配合的OLIG2-eGFP的BAC转基因小鼠（Tg的（OLIG2-EGFP）EK23Gsat）（ 图^1）7,8间的相对定时。
2. 他莫昔芬100％的乙醇溶解，并执行到怀孕的女性在胚胎6.5（E6.5）腹腔注射2.5毫克每40克体重的他莫昔芬诱导Cre表达中的一小部分细胞和DsRed标记。
3. 48小时后胚胎解剖，查明DsRed的阳性胚胎使用荧光显微镜，他们转移到培养皿中观测E单细胞分裂过程中体外成像（见下文）。

2。全小鼠胚胎文化

1. 解剖E8.5胚胎在预热的的洗涤培养基中的DMEM/F12（1:1）中添加10％新生小牛血清和1％青霉素/链霉素（P / ^S）9。
2. 直接解剖后，放置在37℃加热阶段的胚胎在荧光显微镜下识别GFP和/或DsRed的阳性（见下文）。
3. 传输多达2个胚胎成500μl的预平衡补充L-谷氨酰胺的无酚红培养基中含有50％从只Sprague-Dawley雄性大鼠血清和50％的DMEM/F12（1:1）和1％的颗粒在0.85％NaCl和P / S ⁹ 1 M HEPES。
4. 涂抹薄薄的一层（0.1厘米）平衡过的轻质矿物油以防止蒸发，含有胚胎的培养皿转移到37℃，5％CO ₂培养箱_中在中。

3。病毒感染

1. 在以神经上皮纤毛标签，添加5-10微升的SSTR3-GFP慢，约2万病毒颗粒，到500微升平衡下降培养基含有E8.5胚胎。
2. 培养18小时后，感染的胚胎转移到几滴洗涤介质洗出病毒，并准备神经管片。

4。神经管片制备实时成像

1. 解剖神经管预热的洗涤介质中，使用一个微型刀尺寸0.025毫米，在1％的琼脂涂层菜E8.5胚胎。
2. 将孤立的神经管腹侧平衡培养基150μL降不含酚红35毫米的聚-L-赖氨酸镀膜玻璃底菜。
3. 将少量的混合物（1:1）由100％纯凡士林和融化的蜡烛（蜡烛宜家）神经管周围安装，并轻轻按压，以一个狭窄的一块玻璃盖玻片固定样本。
4. 量烹调平衡轻质矿物油（ 图2）有一薄层（约0.1厘米）。

5。实时成像和时间推移共聚焦显微镜

1. 地方菜下尼康的A1R激光的扫描共聚焦显微镜倒置显微镜配备环境室调节温度，设定为_{37℃，5％CO2。}
2. 使用油浸物镜60X记录GFP标记的纤毛和DsRed的阳性细胞，而40倍的油浸物镜使用监控OLIG2 GFP和DsRed阳性细胞的。
3. 打开NIS Elements软件成立时间推移成像条件。每10分钟获得的z叠至25μm，间隔为1.5μm（40倍物镜）和最多8微米，间距为0.4μm的（60倍物镜）。如果需要使用488和561 nm的激发波长和传输通道。收购512×512大小的图像。设置多个用户定义的int地区erest进行同步录制。
   通过使用低激光强度（最多11％561 mCherry EGFP的488分之405高达4.5％），扫描速度1，线路2和平均大小的销孔（61获得最佳曝光的激光功率和图像的亮度的调整红色荧光蛋白微米，28.1微米为OLIG2; 72微米为SSTR3GFP;为红色荧光和SSTR3GFP的61.3微米，58微米DsRed和OLIG2的）。基因编码的荧光记者的使用使我们能够检测到的亮度与激光功率低。
4. 分析记录的数据使用Imaris里三维重建软件。

6。免疫

1. 修复胚胎或孤立的神经管在4％多聚甲醛/ 0.1 M磷酸缓冲液冰（4℃），在玻璃盘1小时。
2. 洗净的样品2小时，在冰上在PBS（4℃）（变化PBS了几次），并把在30％蔗糖/ 0.1 M的磷酸盐缓冲液在夜间或直至胚胎下沉。
3. 嵌入在华侨城，冻结干冰上并储存在-80°C。 Perform切片在低温恒温器（10毫米）。
4. 洗10分钟，在洗涤溶液中含有1％热灭活的羊血清和0.1％的Triton X-100的PBS中的幻灯片。
5. 后浓度稀释在洗涤溶液中的初级抗体：鼠单克隆抗RFP（5F8）1:200;兔抗血清1:1500 Arl13b和小鼠单克隆抗Arl13b 1:5（295B/54）;兔抗OLIG2中1:300;鼠标单克隆抗体，Shh和Nkx2.2所有1:10 PAX6和多克隆Ki67的1:500。新增约150微升平加湿室每张幻灯片，用封口膜覆盖，以避免干燥和遗留晚上，在4°C
6. 洗三次，每次20分钟，在室温下在洗涤溶液中的幻灯片。
7. 在洗涤解决方案1:200浓度稀释第二抗体的Alexa Fluor 488，568，350。使用赫斯特1:3,000或TO-PRO-3 1:500染色细胞核。每张幻灯片中加入150μl，离开1小时，在室温下避光加湿室。
8. 在洗涤溶液总重量洗净幻灯片O次数，每次30分钟，在室温下。
9. 安装滑动在80％，，延长黄金抗褪色试剂和视图的24小时内。

结果

在这里，我们进行体外实时成像单细胞分裂E8.5小鼠神经上皮内。要标记单个细胞，诱导Cre重组酶在细胞内含有一个的酶Cre记者行表达红色荧光蛋白重组后^，5,6（ 图3A）的一个子集。因此，48小时后，我们能够观察到在体外成像（ 图4A-D）的单细胞分裂。随之而来的是，我们监测标记细胞成为嘘响应的包括修改BAC转基因OLIG2-EGFP线（ 图3C-D;图^4G-...

讨论

我们的体外系统，使我们在发展中的神经上皮实时直接观察单个细胞分裂。作为一个例子，我们研究小鼠胚胎神经管内的细胞分裂和监控无论是纤毛形成或嘘响应。我们确认我们的成像效果组（n = 24）与固定部分（N = 178），表明我们的技术提供有关生理数据的结果是一致的。

我们的技术依赖于被限制酶Cre诱导的细胞的一个子集，因此，他莫昔芬的剂量必?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J	Jackson Laboratory	005438
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd	MMRRC,	010555-UCD
CAGGCreER	Jackson Laboratory	003724
Tamoxifen	Sigma	T5648
DMEM/F12 (1:1)	GIBCO	21041-025
Newborn calf serum	Lonza	14-416F
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Rat Serum SD male	Harlan Bioproducts	4520
1M Hepes	BioWhittaker	17-737E
L-Glutamine	GIBCO	21041-025
Light mineral oil	Sigma	M8410
Sstr3-GFP lentivirus	Emory Viral Core
Micro-knife, size 0.025 mm	Electron Microscopy Sciences	62091
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish	MatTek	P35GC-0-10-C
100% Petroleum Jelly	Kroger	FL9958c
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope	Nikon
NIS Elements software	Nikon
Imaris 3D software	Bitplane AG	Imaris 7.2.3
OCT	Tissue-Tek	4583
Cryostat	Leica	CM1850
Heat-inactivated sheep serum	Invitrogen	16210-072
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Parafolmaldehyde	Sigma	P6148
Phosphate Buffer	Lab made
Rat monoclonal anti-RFP (5F8)	Chromotek	110411
Rabbit anti-Arl13b serum	NeuroMab
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5	NeuroMab
Rabbit anti-Olig2	Chemicon	AB9610
Mouse monoclonals Pax6	Developmental Hybridoma Bank	Pax6
Mouse monoclonalsShh	Developmental Hybridoma Bank	5E1
Mouse monoclonals Nkx2.2	Developmental Hybridoma Bank	74.5A5
Rabbit polyclonal Ki67	Abcam	AB15580
Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029
Alexa Fluor 568	Molecular Probes	A11031
Alexa Fluor 350	Molecular Probes	A11046
H–chst	Fisher	AC22989
TO-PRO-3	Invitrogen	T3605
ProLong Gold anti-fade reagent	Invitrogen	P36934