跨体内迟发型变态反应检测方法的抗原特异性调节

Ewa Jankowska-Gan; Subramanya Hegde; William J. Burlingham

doi:10.3791/4454

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摘要

我们描述了一个有价值的诊断方法，有可能被用来决定撤出未经移植排斥反应的风险升高，移植后的免疫抑制。该法采用迟发型超敏反应的原则，并提供准确的评估，既供者特异性效应和调节免疫应答安装收件人。

摘要

体内 T细胞依赖的免疫应答，宿主的免疫系统在最近的过去经历了一个外来抗原（Ag）的表现形式是一种快速的迟发型超敏反应（DTH）。 DTH反应通常分为致敏阶段，指的是最初的抗原经验，挑战阶段，通常如下致敏后数天。往往被视为无能的证据缺乏的迟发型超敏反应皮肤测试证明召回银。传统的DTH试验已有效地用于诊断许多微生物感染。

尽管共享相似的免疫功能，如淋巴细胞浸润，水肿，组织坏死，直接DTH直喷导致致敏供者抗原与移植物丢失的可能性，因为不是一个可行的诊断技术在移植患者。为了避免这个问题，哼哼开发一个鼠标“体内反”DTH检测^1,2。此测试本质上是一个传输的DTH试验，人外周血单核细胞（PBMCs）和特异性抗原皮下注射到羽片或一个天真的的鼠标和DTH像肿胀足垫³ 18-24小时后测量。人类抗原提呈细胞如巨噬细胞或区议会高度血管小鼠组织中的T细胞的抗原提呈触发炎症级联反应，并吸引了小鼠的免疫细胞，导致肿胀反应。该反应是抗原特异性的，并需要事先致敏抗原。一个积极的捐助者反应在电视DTH检测反映的DTH反应，移植的病人已经发展向移植同种抗原的亲炎症免疫处置。

在此检测中最重要的特征是，它也可以被用于检测调节性T细胞，从而引起旁观者抑制。一个旁观者抑制供体抗原的存在是的DTH召回响应特征与接受同种异体移植受者^2,4-14。同种异体反应性和监管的TV-DTH移植术后监测可能确定谁可以受益于减少免疫抑制的患者没有拒绝或肾功能恶化的风险升高的一个子集。

一个有前途的领域是电视DTH检测监测自身免疫^15,16和¹⁷在肿瘤免疫学的应用。

研究方案

1。淋巴细胞的制备

收集血液进入ACD（酸性柠檬酸葡萄糖）管。
按照标准方法，用淋巴细胞分离液从新鲜人外周血的PBMC隔离。
外周血单个核细胞用PBS三次洗净，去除污染的血小板。血小板被发现干扰反式被检体内的DTH试验。最大允许PBMC制备血小板污染是≤1×10 ⁷ /注塑。
如果有明显的红血细胞污染，执行第一次洗涤后，使用ACK裂解缓冲液裂解红细胞。将ACK缓冲液，用PBS洗涤2次。

2。制备特异性抗原

使用上面所示的过程从供体外周血的PBMC隔离。
于PBS中的浓度为120x10 ⁶细胞/ ml（4×10 ^6个细胞/ 30微升）重悬供体的PBMC。
加入1μM的苯甲基磺酰氟的混合物，以防止蛋白质退化。
超声处理的细胞悬浮液，用2毫米的探头超声波破碎仪使用7个1秒的脉冲。（注意：保持材料的冷，并避免过多的气泡，如果出现泡沫，让细胞悬液，坐冰2-3分钟）。
验证使用血球细胞> 90％的中断。
在14,000 rpm离心该混合物在4℃下冷藏20分钟的离心。
上清转移到一个新的2.0毫升安全锁管，并确定蛋白浓度。

3。细胞制备的注射

为每次注射等分7×10 ⁶到2.0毫升安全锁管PBMC。
离心一分钟6000转离心，去除上清。
带或不带抗原在PBS中重悬细胞。调整进样体积为35微升，用PBS。下面的计划是用于注射：
阴性对照：外周血单个核细胞+ PBS
阳性对照：PBMC + TT / DT（25亩克/注射液）
实验抗原特异性反应：外周血单个核细胞+测试AG（4-8微克/注塑）
实验抗原特异性调节：PBMC +测试的Ag + TT / DT

4。测量前，注射，测量后

异氟醚麻醉CB17 SCID小鼠。使用弹簧式卡尺测量后脚掌厚度。认厚度足垫的中心，一个边缘上行走的脚的焊垫接触，以提供一个基准，以保持测量部位一致。脚垫的厚度记录时，压力表读数稳定。
慢慢细胞悬液注入皮下的小鼠使用半CC胰岛素注射器，28号针头的脚垫。针指向脚趾，斜面朝上，执行注入。（注意：确保没有任何泄漏）。
注射后18-24小时，麻醉鼠标垫肿胀与异氟醚和重复测量。
Subtr行事每个足垫的厚度，在注射之前，从后喷射值取得足垫的膨胀值，在10 ^-4英寸为单位表示的数据。计算的抗原特异性的净肿胀：控制垫肿胀（外周血单个核细胞+的PBS）中减去从足垫肿胀的处理获得的值（外周血单个核细胞+供体同种抗原，TT / DT，或供体同种抗原+ TT / DT）。阳性对照响应召回抗原TT / DT≥25×10 ^-4英寸以上背景响应PBS所需的测试被认为是有效的。
确定供者抗原的存在下进行比较，使用下列公式计算各喷射净肿胀抑制召回响应：