在体内双光子成像的经验依赖的分子在大脑皮质神经元的变化

摘要

经验依赖的分子在神经元的变化是大脑的能力相适应，行为问题的关键。一个双光子成像方法的描述，在这里，可以追踪个人皮层神经元的分子变化，通过基因编码的记者。

摘要

大脑的能力来改变响应经验健康的大脑功能是必不可少的，并且在这个过程中的异常导致的脑功能障碍的各种^1,2。为了更好地理解大脑回路的反应机制，动物的经验，需要能够监控的经验依赖的分子在一个给定的神经元的变化，在相当长的一段时间内，在活的动物。虽然经验和相关联的神经活动被称为触发^1,2在神经元中的基因表达的变化^，大多数的方法来检测这样的变化不允许重复观察多天相同的神经元的或不具有足够的分辨率来观察单个神经元的^{3 ，4。}在这里，我们描述了在体内双光子显微镜相结合的方法，经验依赖的基因表达的改变在个别大脑皮质神经元的基因编码的荧光记者跟踪当然，每天的日常经验。

一个行之有效的经验依赖的基因活动调节细胞骨架相关蛋白^{（ARC）5,6。}转录的弧是迅速和高度诱导的神经元的活动加剧^3，其蛋白产物调控谷氨酸受体的内吞作用和长时程突触可塑性^7。电弧中的表达已被广泛使用作为分子标记映射涉及在特定的行为^3的神经回路。在这些研究中，电弧的表达在固定的脑组织切片的原位杂交或免疫组化检测。虽然这些方法发现的表达定位于弧后行为的经验，如何弧的表达模式可能会改变的细胞反复多次发作或独特的经历，天兴奋性神经元的一个子集。 ntent“ 在体内双光子显微镜提供了一个强大的方法来考察经验依赖的细胞变化的活脑^8,9。为了使双光子显微镜检查弧在现场神经元中的表达，我们以前产生了连锁反应鼠标线中，在其中的GFP记者弧的内源性启动子¹⁰的控制下被放置。此协议描述了外科手术准备和跟踪的经验依赖性电弧GFP表达模式在神经元中的活的动物的合奏的成像程序，在该方法中，慢性头颅窗弧-GFP小鼠的皮质区植入这些动物，然后反复后几天的过程中所需的行为范式的双光子显微镜拍摄，这种方法一般适用于动物携带其他的荧光记者的经验依赖的分子变化^4。

研究方案

下面描述的实验过程的心理健康动物管理和使用委员会由国家批准，并按照国家研究院实验动物护理和使用健康指南 。

1。手术前准备

1. 在炎热的珠灭菌器无菌手术前清洗所有的工具，清洁手术部位用70％的乙醇，放下干净的罩布。戴无菌手套。与新鲜制备的1.2％阿佛丁解决方案，由于在0.02毫升/克，腹腔注射麻醉动物。或者，麻醉用异氟醚气体通过一个鼻锥体，用于诱导的5％，1.5％以进行维护，与一个被动清道夫电路。检查用尾巴或脚趾捏，以确保全面镇静麻醉水平。
2. 量的动物的眼睛用无菌的眼用软膏，并注入新鲜制备的地塞米松（0.2毫克/千克），卡洛芬（5毫克/公斤）subcutaneously以防止脑水肿及炎症^11。刮头发，两耳之间的头骨，并与聚维酮碘擦洗和三个交70％的酒精棉签消毒皮肤。
3. 挂载该动物在立体定位手术与earbars阶段，在37℃下与下面的动物组的水环流加热垫定期检查动物的麻醉水平，并根据需要补充原有的麻醉剂量。
4. 注入200μL0.5％的疼痛控制下的头皮麻木的区域。在头骨切开皮肤及去除皮瓣。删除骨膜，用干净的棉签和干燥的地区。

2。慢性颅窗手术

1. 使用一个高速牙钻一个0.5毫米毛刺，轻轻地勾勒出一个3-5毫米直径的圆过的大脑区域的利益。定期湿钻井现场，用无菌0.9％生理盐水和清除骨用干净的棉签上的灰尘。如果骨出血，用gelfoam浸种用无菌生理盐水涂抹出血，并等待其停止。
2. 当最后的骨层，细尖镊子提起并取下骨岛。杜拉附件的底架上的骨头，可能会遇到，如果窗口越过骨缝。这些应轻轻取出的骨瓣解除。
3. 辊蘸明胶海绵轻轻地覆盖在外露的硬脑膜清洁其表面，并等待硬脑膜出血停止。 关键的步骤：请不要继续，直到所有的硬脑膜出血已停止。血液变得被困在里面的颅骨窗口通常会导致一个不透明的窗口。
4. 如果感兴趣的区域是硬脑膜的位置是特别厚，除去它上面的硬脑膜下可能是必要的。如果是这样的情况下，轻轻分开硬脑膜从软以下，非常细的钳子，使一个小切口，在解除硬膜与另一对细钳子，然后抓住切割边缘，并轻轻分裂硬脑膜。硬膜薄，但强大的，所以要小心不要切的大脑完整的硬脑膜边缘。
5. ，用无菌的ACSF或无菌生理盐水冲洗区。
6. 躺在无菌的盖玻片（3-5毫米）以上的持续时间或软。 关键的步骤：如果周围的头骨曲线显着，使用Kwiksil ¹²胶粘剂填补的空间硬脑膜或软将不紧密的接触盖玻片地区将不被成像。
7. 使用氰基丙烯酸酯凝胶覆盖的弹性体粘接剂和玻璃盖玻片的边缘。覆盖整个暴露颅骨氰基丙烯酸酯胶，或krazyglue和牙科水泥混合物。 关键的一步 ：不要让任何氰基丙烯酸酯凝胶接触到大脑表面。
8. 嵌入一​​个特制的金属头固定杆的另一端的头骨。
9. 动物返回到温暖的回收室，一个intraperitonial酮洛芬，注射5毫克/公斤，对于后ŕ疼痛管理。持续两天手术后的镇痛。
10. 经过两个星期的术后恢复，动物麻醉与异氟醚（归纳为5％，1.5％，为维护），将其安装在一个特制的显微镜载物台头固定架，并检查颅窗的透光与蓝色光的照射下。脑表面血管清晰颅窗质量的高度指示。如果血管边缘分明，窗口是可能是可用的。两个星期的手术后的恢复时间，这样就可以有足够的时间从手术中恢复过来的动物。颅窗口通常清除和改善，在这段时间内，并保持光学透明额外的几周到几个月，直到再生的颅骨或硬脑膜增厚窗口质量下降。

3。行为协议和激光扫描双光子显微镜

1. 动物有明确的Çranial窗口将被暴露在环境刺激或行为训练会话，然后成像后在最大弧GFP表达的时间。动物开始行为协议之前，应保持在一个一致的饲养笼的环境，以尽量减少一天到天基线电弧GFP表达水平的变化。
2. 行为训练或环境刺激范式开始，根据对大脑的地区的利益。例如，动物可以接触到不同的视觉环境，在连续数天，和视觉上的刺激，以识别特定刺激的反应在视觉皮层的¹⁰后拍摄的每一天。
3. ARC-GFP荧光的神经元通常两个小时后，刺激达到了登峰造极的地步。实验时间轴可以优化，以便于检测电弧在神经元中的GFP表达的荧光峰值水平。
4. 后一个行为的训练或environmenta的升刺激，麻醉动物，异氟醚（归纳为5％，1.5％，为维护）和双光子显微镜安装在为客户定制的显微镜载物台头固定框架下的动物。
5. 动物的头位置是固定的，直接连接到舞台上，使用植入的金属条上的骷髅头固定架。异氟醚和氧气连续地供给到鼠标通过鼻锥体。使用加热垫，保持体温。
6. 确保在一个黑暗的房间中进行双光子激光扫描显微镜，环境光探测器的保护。使用20倍或25倍的水（1.05数值孔径）浸没透镜的成像。首先，外延荧光照明下，获得的图像在大脑区域感兴趣的用CCD照相机未来图像对齐表面的血管图案。
7. 启动双光子激光扫描获得3-D图像堆栈。使用Olympus FV1000MPE多光子显微镜被用来在我们的设置。的双光子激光的激发波长设定为920纳米，和从目标发射的激光的功率被设定为约50毫瓦。同时检测在绿色和红色通道中（在570 nm处的分色镜，在495-540 nm和570-625纳米的屏障过滤器），使用一个外部的双通道的photomutiplier检测系统放置在靠近试样发出的荧光。 ARC-GFP荧光只出现在组织的自体荧光的绿色通道，而出现两个通道中的^13，14。
8. 典型的图像栈具有约320x320x100微米的尺寸（宽度×长度×深度），水平分辨率为0.5μm/像素​​，和垂直分辨率为3μm/像素​​。
9. 获取图像的堆栈后，返回到其家笼子里的动物。请勿打扰的动物，直到下一次的行为和成像会议。重复的行为和成像整个天DESIR程序编辑。使用先前获得的脑表面的血管图像的方向返回到相同的成像位置。

结果

该协议描述了一个方法来跟踪个人皮层神经元在活的动物的经验依赖的分子变化。一种慢性颅窗口第一次创建了一个带有荧光的记者在小鼠基因表达的兴趣皮层区域。双光子显微镜然后可以加上各种行为范式来观察行为诱导的分子变化，个别神经元和跟踪多天（ 图1）在相同的一组神经元中的这种变化。

弧-GFP小鼠，可以可靠地成像依赖于经验在Arc基因的表达...

讨论

这里描述的体内成像方法，使弧基因表达的变化在相同的一组神经元在活的动物多天的反复检查。这是一个高效，灵活的方法来获取信息在单个神经元的神经可塑性相关的分子动力学响应不同的行为体验。标准组织化学方法，如原位杂交和免疫组织化学可以实现单细胞的第^{3号决议，}但缺乏能够跟踪多天在同一个神经元的基因表达的变化。通过适当记者¹⁵生物发光，磁...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
设备名称：	公司	目录编号	评论（可选）
FV1000多光子激光扫描显微镜	奥林巴斯	FV1000MPE	成像
解剖显微镜	Omano	555V107	手术
立体定向手术对小鼠的阶段	哈佛设备	726335	手术
20X或25X水浸物镜	奥林巴斯	XLPL25XWMP	成像
显微镜载物台头固定架	订制	N / A	成像
精细镊子	精细科学工具	11251-20	手术
钻牙毛刺	精细科学工具	19007-05	手术
CCD相机	QImaging	QICAM 12位	成像