在EMBL的MultiBac蛋白质复杂的生产平台

摘要

蛋白质复合物催化关键的细胞功能。详细的功能及结构表征多种人体所需的复合需要重组生产。 MultiBac杆状病毒/昆虫细胞表达真核蛋白质及其复合系统特别定制。 MultiBac实施作为一个开放的接入平台，开发的标准作业程序，以最大限度地发挥其效用。

摘要

蛋白质组学的研究揭示了令人印象深刻的复杂的真核蛋白质组前所未有的细节。它现在是一个普遍接受的概念，细胞中的蛋白质主要存在不是孤立的实体，但发挥其生物活性协会与许多其他蛋白，在人类十个或更多的大多数，如果不是所有的重要职能，在细胞中形成组装线^{1。 ，2}这些多蛋白组件的功能和体系结构的知识，需要他们提供卓越的质量和足够的数量进行详细的分析。细胞的多蛋白复合物的缺乏，特别是在真核生物中，禁止其提取从本地源，必须重组生产。杆状病毒表达载体系统（BEVS）已被证明是特别有用的真核蛋白质的制造，其中的活性往往依赖于翻译后加工等常用的表达系统通常可以不支持的^。3的 BEVS使用到其中的感兴趣的基因插入的重组杆状病毒感染昆虫细胞培养物，这反过来又产生蛋白质给出。 MultiBac是一个BEVS已特别专为生产的真核细胞的蛋白质复合物包含许多亚基⁴高效生产的蛋白质和它们的配合物的一个重要的先决条件是，理想的情况下可实现为在表达式中实验所涉及的所有步骤的可靠的协议标准操作程序（SOP），随后也由非专业用户比较容易。 MultiBac在欧洲分子生物学实验室（EMBL）的平台使用的SOP在多蛋白复合表达实验中所涉及的所有步骤，从基因插入杆状病毒基因组的小规模分析的蛋白质的异源蛋白质的生产性能优化的一个精心设计的标本制作^。5-8平台安装在EMBL格勒诺布尔在一个开放获取模式，并支持许多来自学术界和产业加速蛋白复合物的研究项目的科学家。

引言

控制生物活性蛋白质和其他生物分子采取一致行动，促进细胞的功能组件。著名的例子包括机械，转录成信使RNA的DNA中包含的遗传信息。在人类中，超过100种蛋白质在界定和规范的过程中走到一起转录基因，是形成大的复合物，10多亚基RNA聚合酶II和一般转录因子如TFIID，TFIIH和其他⁹其他的例子包括核糖体，由许多蛋白质​​和RNA分子，催化蛋白质的合成，或者是负责穿梭生物分子通过在真核细胞的核膜核孔复合。一份详细的建筑和生化基本上所有多元的机器在细胞解剖，以了解它们的功能是至关重要的。的原核生物和eukar的结构鉴定例如，核糖体yotic，构成产生前所未有的洞察这些大分子机器如何开展其指定的功能，在细胞的标志性事件^。10,11

核糖体，可以得到足够的质量和数量进行详细研究中，通过纯化从培养细胞中的内源性物质，由于这样的事实，细胞质量的30％，由核糖体。 RNA聚合酶II已经是不太丰富的量级，和几千升酵母培养物处理，以取得详细的原子鉴于这种必需的复杂的中央转录¹²然而目前在绝大多数其他必要的配合低得多的原生细胞，因而不能充分纯化从本地源材料。为了呈现这种复合访问详细的结构和功能分析，需要利用异源生产重组德chniques。

重组蛋白的生产产生了重大影响，对生命科学的研究。许多蛋白质​​是重组产生的，并且它们的结构和功能，在高分辨率解剖。结构基因组学计划已利用阐明整个生物高通量（HT）模式来解决基因产物的剧目很多生物的基因组。数以千计的蛋白质结构已被确定。到今天为止，最力强的重组蛋白生产系统已经E.多年来在此主机中的异源生产的大肠杆菌 ，以及许多表达系统已被开发和高雅。质粒窝藏了大量的功能，使蛋白质在大肠杆菌中生产大肠杆菌填满整个商业供应商目录。

然而，E。大肠杆菌具有一定的局限性，这使得它不适合产生许多真核生物蛋白在p关节与许多亚基的蛋白质复合物。因此，在真核宿主中的蛋白质生产方法的选择在最近几年已经变得越来越。一种特别适合的系统产生的真核生物蛋白是杆状病毒表达载体系统（BEVS），它依赖于携带异源基因的重组杆状病毒感染昆虫细胞培养在实验室中培养。 MultiBac系统是一个特别适合用于生产许多亚单位（ 图1）的真核细胞的蛋白质复合物，最近开发的BEVS。 MultiBac MultiBac在2004年首次推出¹³自推出以来，已不断完善和流内衬简化处理，提高目标蛋白的质量，一般非专业用户访问系统通过设计有效的标准操作程序（SOP）。在许多世界各地的实验室，交流已实施⁴ MultiBacademia和行业。在格勒诺布尔EMBL的，跨国的访问计划落实到位，由欧盟委员会提供专家培训在MultiBac平台，科学家们希望推进他们的研究，使用这种生产系统。迄今无法访问的多蛋白复合物的结构和功能鉴定，通过用MultiBac样品^。4在下文中，总结于MultiBac生产的基本步骤的协议，因为它们是在操作在EMBL格勒诺布尔MultiBac设施。

研究方案

1。串联重组工程（TR）用于创建多基因表达结构

1. 规划的共表达策略 。你感兴趣的基因插入到供体和受体的设计方法。您的复杂的潜在生理子模块应集中在特定的接受者和捐助者。用乘法模块组成的归巢核酸内切酶（HE） - BstXI位对个人的供体和受体质粒表达盒结合^7,8建立在硅片和所有相关的构造彻底验证策略，然后再进行试点工作。例如，感兴趣的基因应检查不包含HE或其他限制性位点的正确的开放阅读框（ORFs）的存在下进行验证。考虑订购合成基因昆虫细胞密码子的使用和mRNA的二级结构进行了优化，以提高蛋白质的生产水平以及去除任何鄂西蜇HE网站感兴趣的基因。关于灵活或暴露的N-或C-末端蛋白选择从文献数据的基础上考虑将净化标签。考虑申请聚战略，着眼于生产多种蛋白质亚基在复杂，如果单个蛋白的相对量在复杂的由于化学计量问题，需要加以控制^。4准备详细的“如何”文件（电子实验室本书推荐）预计该项目的实验步骤，完整的多基因结构（次）。建立电子档案的Cre-LoxP位融合质粒例如伯杰组www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / CRE-acembler的主页（ ）可以直接从网上下载使用CRE-ACEMBLER的软件。
2. 你感兴趣的基因插入到选定的捐助者和用限制性内切酶和连接酶，或者，通过使用独立结扎方法后发布的协议。受体^5,6,14如果您有液体处理工作站的访问，如果你计划要产生大量的结构（例如组合方法）考虑使用机器人脚本伯杰组（ 图^2）。14,15制定和实施，如果液体处理站工作，手动操作使用微孔板允许基因插入在HT喜欢时尚。
3. 需要表达亚基的化学计量控制所施加的约束可能会实现。在化学计量学上不均衡的蛋白质复合体的各个亚基的表达水平的情况下，可以考虑应用多聚策略相合由s隔开的单个大的ORF中的一些亚基的复杂和特定的蛋白酶（例如烟草蚀纹病毒的NIa蛋白酶）蛋白水解网站pecific ^4,8考虑共同表达一个或多个多聚单表达盒，如果你有一个非常大的复杂许多亚基和广泛单个亚基分子量不等。考虑共同表示几个相同的蛋白质编码基因中的多聚或几个相同的表达盒的特征在于，如果该蛋白产品收率低^。4,13
4. 验证所有的供体和受体的结构通过的限制映射（可选高通量）和测序克隆。继续的Cre-loxP重组融合给体 - 受体组合生成的多基因表达结构的选择。验证纯化接受器捐助者融合质粒的限制映射，使用创建的电子序列利用Cre-ACEMBLER的或类似的计划作为参考。
5. 纯化和验证的捐助者，受体和供体 - 受体融合存放在-20°C或-80°C。存档PLasmids序列（Microsoft Excel中，FILEMAKER，其他）仔细供以后使用。

2。复合多基因杆状病毒代，扩增和存储

1. 整合多基因转移载体MultiBac的的杆状病毒基因组DH10细胞转化成窝藏病毒的基因组和TN7换位需要的功能。需要注意的是杆状病毒基因组Multibac由体内酶Cre反应前Tn7转集成在与感兴趣的特定基因（YFP标记，分子伴侣等）在其自己的LoxP位站点（工程远端Tn7转附着位点到基因组中），可以被预先加载。 ¹³ TN7换位后复合杆状病毒包含的基因，细胞蓝/白筛选（成功TN7换位业绩亏损的β-半乳糖苷酶的α-互补，因此，保持白色菌落正确TN7换位选择性一个选择石榴石含有X-gal的平板）和基因组的制备采用碱裂解和乙醇/异丙醇沉淀^。5,6
2. 转染和最初的病毒生产 。广场6孔培养板放入无菌罩。从对数期的Sf21昆虫细胞培养，种子满分井和转染细胞的等分试样，加入纯化的杆状病毒基因组和混合在培养基中的转染试剂，如所述^。6收获后48-60小时的初始病毒移除媒体（高品质，低滴度的病毒V _0，一般为3毫升，每孔）。补充新鲜培养基和测试^6,7蛋白生产后2-3天（YFP标记如果存在，荧光）。
3. 扩增病毒，低MOI方案 。使用V ₀病毒感染25-50毫升对数生长期的细胞（细胞密度<1×10 ⁶细胞每毫升）小（100-250毫升）锥形瓶瓶激动的轨道平台呼风唤雨（ 图3）。计数细胞和细胞分裂每24个小时，直到停止倍增（增殖被捕）。按照低MOI（多重感染， 即每个细胞的病毒颗粒）的方案：细胞必须加倍（至少）一次（MOI <1），否则重复实验，更小的体积V _0。通常情况下，V ₀ 3毫升用于感染的Sf21昆虫细胞中的25毫升的密度为0.5×10 ⁶细胞/ ml。这是必要的，以防止有害的过度放大和自动删除病毒，可能导致的异源基因的利益损失。收获V ₁病毒（25-50毫升）48-60小时后，通过制粒细胞和去除含有病毒的媒体。补充新鲜的培养基和试验，每12或24小时，除去（1×10 ^6个细胞），制粒和验证蛋白质的生产和标记蛋白（YFP）信号^。6 YFP的蛋白质生产，病毒扩增（到V _2）进一步表达量较大的目的是通过感染2摇瓶400毫升细胞与V ₁病毒尊重上述低MOI方案（细胞必须加倍至少一次感染后V _1）。严格测试蛋白质生产和标记蛋白信号在放大过程中避免积累不再含有您感兴趣的基因缺陷病毒^。5-7使用细胞颗粒积聚在每个扩增步骤已经建立利益表达的蛋白复合物的净化协议。
4. 生产病毒的BIIC存储 。我们强烈建议使用存储V ₂病毒作为生产病毒BIIC（B aculovirus 我我 NSECT nfected的C ELL学生）的方法，以防止修改（ 如失去感兴趣的基因）的重组病毒，并保留高表达水平¹⁶颗粒感染细胞增殖逮捕后24小时观察-在这一阶段细胞含有完整的病毒颗粒之前，他们会被释放到媒体（萌芽）。取出介质，在液氮中冷冻等分的细胞沉淀，并存储^7,16下去。

3。蛋白质生产及下游加工

1. 感染大（R）文化和监测YFP。使用V _{1，V 2}或冷冻BIIC等分感染的细胞培养物的生产运行（在2L烧瓶通常400毫升）。坚持低MOI方案（调整病毒感染感染培养双打至少一次的使用量）。烧瓶数乘以放大感染培养卷，如果需要。 YFP标记蛋白存在，退出定义的时间间隔为1×10 ⁶细胞，颗粒和细胞溶解和监测YFP的信号演变，直至达到一个高原工业icating最大生产重组蛋白。 YFP的电平可以在一个标准的96孔板的读者能够记录荧光信号（ 例如，Tecan公司SPECTRAFluor）的测量。在这个阶段的收获细胞。细胞颗粒存储于-20℃（短期）或-80℃（长期）。
2. 细胞裂解和分级分离 。您最喜爱的首选方法，蛋白质（冻融，超声，法国媒体，其他）的要求量身定做。裂解细胞^5-7分馏细胞质和细胞核和测试您感兴趣的蛋白质的存在。开发提纯协议，成果的基础上，以简化蛋白质纯化。考虑申请浸泡程序，提取蛋白的核分数高氯化钾条件下，如果驻留在细胞核中的蛋白质^。7,18
3. 蛋白质纯化（微观尺度，大规模）。需要注意的是细胞培养的往往是小卷（10或25毫升）是苏fficient获得的细胞沉淀净化您感兴趣的蛋白质大量典型的高或非常高的异源蛋白的生产水平在杆状病毒/昆虫细胞系统（通常是10-100毫克每升的文化和更多的蛋白质）。 ，微净化（多孔板，微尖的方法，GE医疗ÄKTAmicro系统，其他的）相结合，这是可能的获得生化和活动的数据，常常也足够量的纳升规模的高通量结晶所需的蛋白质和复合物（HTX ）。暴露的蛋白复合物的亚单位，以便净化，连同小的离子交换和尺寸排阻色谱法，可以考虑使用金属亲和纯化（Qiagen公司的NiNTA CLONETECH宝TALON金属螯合剂树脂）和寡聚组氨酸（6-10个氨基酸残基）标签例如使用ÄKTAmicro的或类似的小体积净化机（ 图4卷）。其他亲和纯化步骤和离子交换（IEX）在除了与寡聚组氨酸标签或其他标记的亲和纯化步骤（GST，MBP，CBP，其他选择）即可，并应考虑，根据蛋白质的生化特性的兴趣和个人喜好。考虑标记一个以上的子单元与亲和标签，以提高净化效率。浓缩纯化的蛋白复合物，并建立存储协议，如冻结或不含甘油。制定质量控制标准，可以应用标准（活性​​试验，生物化学和生物物理测试），以评估纯化的蛋白质批次与批之间的变化。

结果

斯特朗合作MultiBac系统所实现的异源蛋白质的表达示于图1d（探针感染细胞悬浮培养后48小时）。在整个细胞提取物（SNP）和澄清的裂解液（SN）的过表达蛋白条带清晰可见。所产生的蛋白原料的质量和数量往往是足以使图1e中所示的结构测定的蛋白质复合物，例如有丝分裂关卡复杂MCC ¹⁷

图2显示了由机器人辅助串联重组工程（TR）?...

讨论

视频管理单元射击在图2和图3中示出的整个过程，从机器人辅助发电的多基因表达的cDNA，构建感染的昆虫细胞培养生产蛋白质的方式。已经开发了新的试剂（质粒和病毒）和可靠的协议，使管道依靠的SOP。整个管道已经实现在EMBL格勒诺布尔作为一个平台技术。 MultiBac平台已访问许多来自学术界和工业界的科学家所从事的多蛋白的研究。培训访问支持由欧盟委员会资助（P-...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetracycline	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine	Euromedex	EU0420 (25 g)	1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine	SIGMA	G3632 (5 g)	1,000X at 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1,000X at 1M
Cre-recombinase	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
6-well plate Falcon	Dominique Dutscher	353046
2 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357507
5 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357543
10 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357551
25 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357535
50 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357550
50 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352070
15 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352096
1.8 ml cryotube Nunc	Dominique Dutscher	55005
100 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211917
250 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211918
500 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211919
2 L shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211921
Certomat Orbital Shaker + plateau	Sartorius	4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Biological Safety Cabinet Faster	Sodipro	FASV20000606
Optical Microscope	Zeiss	451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus	TECAN
10 μl conductive tips (black),	TECAN	10 612 516
200 μl conductive tips (black)	TECAN	10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted	Eppendorf	0030 128.648
96 well V bottom, non sterile	BD falcon	353263
96 deepwell plate color natural, PP)	Fisher	M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom	Greiner	655101
96 deepwell plate	Thermo scientific	AB-0932
24 well blocks RB	Qiagen	19583
DpnI restriction enzyme	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	homemade		7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1% agarose GP	Life Technologies	G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit	Macherey Nagel	740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq green master mix	Promega	M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	homemade
Urea 2 M	homemade
EDTA 500 mM pH 8.0	Homemade
LB broth (Miller) 500 g	Athena ES	103