新生儿脑室下区电穿孔

摘要

我们展示出一种微创技术，新生儿脑室下区电。该技术包括新生幼崽的侧脑室注射质粒DNA和通电时提供神经干细胞和基因操纵

摘要

神经干细胞（NSCs）线的产后侧脑室，并产生多种细胞类型，包括神经元，星形胶质细胞和室管膜细胞。了解，利用其独特的修复潜力更好地理解大脑和中枢神经系统紊乱的分子通路的负责NSC的自我更新，承诺和分化是至关重要的。往前哺乳动物系统操纵的方法需要耗费时间和昂 ​​贵的基因工程的努力在整个动物的第²级。因此，绝大多数研究探讨NSC分子在体外或在无脊椎动物中的功能。

在这里，我们展示了技术操作简单，快速的新生儿的NPC，被称为新生儿脑室下区（SVZ）电。十年前制定类似的技术来研究胚胎神经干细胞，并资助研究cortical开发^3,4。最近研究产后的啮齿动物前脑^5-7。这种技术的结果SVZ神经干细胞在强大的标签和他们的后代。因此，产后SVZ电哺乳动物国科会基因工程提供了成本和时间效益的替代方案。

研究方案

本程序是在按照与耶鲁IACUC要求。科学家应确保IACUC准则的批准，随后根据其机构的要求。

1。第1节。制备DNA，解决方案和玻璃吸管

1. 生成高纯度（OD 260/280> 1.80），高浓度（微克/微升> 2.5）内毒素的DNA。
2. 准备0.9％的生理盐水溶液和无菌过滤器，通过一个22微米的过滤器。
3. 将10厘米火抛光的高硼硅玻璃毛细管（OD：1.5毫米，1.10毫米）到一个模型中PP-830成茂PC-10玻璃吸管车夫与康泰尔线。设置拉马一步加权拉在70.5°C。打破圆形钳的提示和检查锯齿状刀刃在解剖显微镜下。锥技巧和在紫外线灯下为15分钟。被拉移液器应标记的前端边缘在2毫米。
4. 准备0.1％重量/体积快速绿色的解决方案无菌过滤通过混合0.9％的生理盐水溶液用干燥的快绿。

2。第2节。动物制备，玻璃吸管装载和质粒注射液

1. 0-1幼崽分别从笼子里取出出生后，到玻璃培养皿预冷至4°C，然后湿冰的地方。
2. 大约5分钟后，确定麻醉状态的，利用脚捏响应。如果没有运动时，幼崽脑室注射。
3. 重要的是要注意，快速绿色，DNA，和盐溶液的组合可以导致的玻璃移液管的迅速蒸发，结晶，和封锁。因此，生成的储备液和等分试样1-2微升到石蜡紧接之前注射。
4. 拉玻璃吸管吸出整个等份量。
5. 保持你少惯用手的拇指和食指之间的小狗的头。
6. 灯的开启D保持头部的小狗，外面的光线。如果需要，用盐水头，以减少反射的光的量由小狗。心室现在应该亮起。
7. 你的惯用手，将针插入侧脑室最接近（ 图1A和1B）。注射的部位应是约从人字缝和眼睛和2毫米矢状缝外侧等距。拉移液管插入到2毫米大关的一个P0小狗，应保证焊透入侧脑室。巧合的是，你可能会看到回填土的CSF释放颅内压到吸管。为了降低颅内压，这有助于在注射质粒，放松你的抓地力头的pup.Step 2.8。约0.5μL的质粒注入侧脑室，使用高压空气喷射器（Picospritzer，帕克）。

3。第3节。电穿孔和恢复

1. 硒t为5平方脉冲，50毫秒/脉冲在100伏，950毫秒的间隔电压电穿孔发生器。质粒电穿孔的空间特异性取决于由电荷转移的方向性。应给予密切关注的位置沿SVZ ⁸的干细胞群的异质性。已被确定为腹，背和头端尾部的位置^9,10增殖和细胞的命运率的差异。
2. 一旦该质粒被注入到PBS，浸涂镊子电极。这一步是为了最大限度地提高电荷转移和防止烧伤引起的电阻率。
3. 放置的正电极上的背侧壁小狗质粒注射的部位（ 图1C和1D）同侧靠近耳朵。将负极放在对侧半球腹外侧的小狗的鼻子。
4. 按启动电流传输脉冲脚灯巫婆脚踏板和扫背的电极，横向〜25°角的时间间隔。
5. 广场电穿孔的幼崽到5分钟的加热垫。轻轻转动幼崽，每30秒有轻度刺激。

结果

新生儿脑室下区电在几乎所有的放射状胶质连续的背，背外侧和侧脑室下区继“清扫”运动的镊子电极（ 图1E）的标签。然而，电可定制的要求，在各自的实验，但不扫电极，并使用特定的位置和方向，详细的视频。例如，由于背侧局部放射状胶质不同于那些衬心室的横向部分，一个可以选择只有一个单一的区域^9,10 electroporate。更多特殊性的也可以使用较小的电极。

讨论

在这里，我们详细新生儿SVZ电的技术，这种技术能够迅速和有力的标记和操作SVZ干细胞和它们的后代。有几个优点，在与其它技术相比，电穿孔具有。首先，考虑的重点标记的细胞，一个是能分辨细胞自主和非细胞自主的影响。其次，使用诱导系统的遗传操作，允许一个用来比较的效果之前或之后突触融合。此外，人们可以绕过使用多个质粒与含有loxP位点的质粒通过电穿孔CRE表达小鼠。第四，报...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论（可选）
重抛光的高硼硅管	萨特仪器	BF150-110-10
双级玻璃微普勒	成重	PC-10H
固绿	菲舍尔科学	0521192205
ECM 830方波脉冲发生器	哈佛设备	45-0052
Tweezertrodes	哈佛设备	45-0488
光纤光源	Fisher Scientific则	12-562-36
卤钨灯灯	USHIO美国公司	1002247
Picospritzer II	帕克工具	052-0312-900