从手术标本的人类胰岛细胞激光显微切割的改进方法

摘要

激光显微切割是一种技术，使选定单元格的恢复微量的实质。在这里，我们描述了一个协议，收购手术标本用于转录组研究人类胰岛。我们的协议提高了内在的自发荧光的人类β细胞，从而有利于他们的收藏。

摘要

激光显微切割（LMD）是一种技术，它允许微量的实质^1,2选定的细胞和组织的恢复。解剖的细胞可以用于各种调查，如转录或蛋白质组的研究中，DNA的评估或染色体分析^2,3。尤其是具有挑战性的应用LMD转录组分析，由于⁴ RNA的不稳定性，可以表现尤为突出，有丰富的核糖核酸酶，如胰腺组织细胞解剖时。一个显微切割技术协议，能够快速识别和收集的靶细胞，在此设置中是必不可少的，以组织处理时间缩短，因此，为确保RNA保存。

在这里，我们描述了一种协议，用于获取要用于转录研究⁵从手术标本的人胰岛β细胞。小件胰腺约0.5-1Çm ^3的被切断从健康出现边缘切除胰腺标本，嵌入在Tissue-Tek OCT化合物中，立即冷冻冷藏2 -甲基丁烷，并保存在-80℃下，直到切片。 40连续切片厚度为10μm的低温恒温器上切下在-20°C的设置，传送单独的载玻片，在低温恒温器内干燥1-2分钟，并储存于-80℃。

紧随激光显微切割过程之前，在冰冷的固定切片，新鲜制备的70％乙醇中30秒，由冰冷DEPC-处理水的5-6蘸洗涤，并脱水，在冰冷的100％由两个一分钟的孵育乙醇后跟二甲苯（这是用于组织脱水）4分钟，组织切片，然后空气干燥，之后为3-5分钟。更重要的是，所有的步骤，但在二甲苯的潜伏期，进行使用冰冷试剂-一个修改过先前描述的协议^6。 UTilization冰冷的试剂导致β细胞的内在自发荧光的显着增长，促进了他们的认可。显微切割，四个部分脱水，每次放入一个用箔纸包裹50毫升管，以保护组织的水分和漂白;，立即显微剩下的两个人。使用PALM微束仪器（蔡司）采用自动激光压力弹射模式（AutoLPC）的程序进行。的完成四个冰冻切片不再需要40-60分钟的β细胞/胰岛夹层。将细胞成一个AdhesiveCap收集，并与10μl的裂解缓冲液中裂解。每个单个RNA转录组分析用试样，得到通过组合10个细胞显微切割的样品，随后使用的Pico纯RNA分离试剂盒（大角星）RNA提取。该协议提高了内在的自发荧光的人类β细胞，从而促进他们的快速，准确识别和collection。进一步改进这个程序可以使β细胞的表型不同的解剖，更好地理解与2型糖尿病有关的变化可能产生的影响。

研究方案

1。冻结的人类胰腺组织

1. 取出脂肪组织，血管，神经和非实质组织，用手术刀和镊子，并切断胰腺组织成片（约0.5-1厘米立方体）。
2. 胰腺组织一块在中心，一个Cryomold，并覆盖它完全用冷水组织康OCT复合。将Cryomold成一个jar的底部覆盖有预冷却的2 - 甲基丁烷和管理单元在液氮中冷冻。在-80℃下冷冻样品存放

2。冰冻切片的制备

1. 戴上手套，在所有步骤，以避免变性的RNA。
2. 清洁用冷水100％的乙醇和RNase客场刀低温恒温器，样品架和画笔。将冰冻组织内的低温恒温器。
3. 等待，直到组织，刀，刷子达到-20°C。标签的Superfrost Plus幻灯片和预冷却，低温恒温器内室，而等待组织达到-20℃。
4. 应用组织康OCT化合物的试样架和将冰冻组织之上。
5. ，组织康OCT复合一旦被冻结修剪cryoblock和删除任何多余的组织康OCT复合用刀片。
6. 剪下共连续40 10μm的切片，从胰腺组织块。此外，我们还建议要保存图纸，可以方便的识别切片的显微切割过程中的胰岛细胞内的胰腺部分概述第一和中间片切割。
7. 传送部从刀片的中心通过触摸的背面侧的滑动用手指（覆盖的手套箱）只升温到的区域的部分，应当坚持一个的Superfrost Plus滑动。
8. 干燥的部分1-2分钟内的低温恒温器在-20°C，之后，你把它们放到一个滑动箱置于干冰上。存储的部分在-80℃下
9. 如有必要，请用纸巾和100％冷乙醇刀。

3。冰冻切片脱水

1. 准备试剂：倒入30毫升新鲜制备的70％的乙醇，30毫升DEPC-处理水，2×30毫升100％的乙醇和30毫升二甲苯入50ml蜂星管（猎鹰）;寒意所有试剂（除二甲苯）并保持在冰上。
2. 用100％乙醇和RNaseZAP清洁引擎盖下的工作空间。
3. 过程2冷冻切片如下：固定在冰冷的70％乙醇中30秒，用5-6快速蘸冰冷DEPC-处理水，脱水两次冰冷的100％乙醇中的1分钟，在二甲苯中孵育4分钟在室温下（25℃），并空气干燥3-5分钟。重复此步骤，与另一对冰冻切片。
4. 将两个干冰冻切片，背靠背用锡纸包裹，以保护他们免受光照和水分到50毫升蜂星管。

4。蔡司PALM微束，β-细胞的激光显微切割

1. 清洁的显微镜，RNaseZAP，并安装胶盖在RoboMover。
2. 进行以下设置：过滤器设置09（激发波长450-490 nm，发射515 nm处），AutoLPC模式，50％的激光能量，65％的激光焦点，100％的激光测速，5微米之间的距离AutoLPC拍摄，6微米的距离线，工作高度：-10,100。
3. 一张幻灯片插入到舞台。
4. 找到β细胞的自体荧光显微镜下可视（5倍或10倍镜头）。
5. 切换到40倍的镜头，与“写意”选择工具选择的β细胞，他们利用激光显微切割。
6. 捕捉四个脱水冰冻切片组织到一个AdhesiveCap。
   注释1：解剖一个脱水冷冻切片的β细胞的时间不应该超过10-20分钟，以避免补液的组织切片，这将导致RNA的降解。
   注释2：验证成功后，通过​​目测显微切割过程阶段的检查点。

5。裂解染色体富含β细胞的组织

1. 删除从RoboMover AdhesiveCap。
2. 吸取10μL提取缓冲液（XB，PicoPure RNA提取试剂盒，大角星）到的AdhesiveCap盖下培养倒挂在42°C 30分钟。
3. 自旋向下在10,000 xg和把裂解干冰。将它存储在-80℃，直至进行RNA提取。
4. 重复步骤3）〜5）。与所有其他部分。

6。 RNA提取

1. 将所有10个10微升裂解液
2. 继续进行，通过在室温下工作根据协议的RNA分离试剂盒，大角PicoPure，使用以1:1的比例至70％乙醇（包括DNA酶处理）的提取缓冲液（XB）的RNA分离。

7。 RNA分析

1. 使用1微升RNA的质量和数量，使用Agilent 2100 Bioanalyser（PicoChip公司）进行分析。定量评价是参照装在芯片上的平行的标准RNA。

结果

正如图1中所示，修改后的脱水协议导致的β细胞的自发荧光的改进相比，以前的发布的协议^6。应用所描述的协议，每个39手术胰腺标本被用来生成40串行冰冻切片的平均31'544'704微米³组织/胰腺试样（范围：8'742'390 - 81'522'153微米^3）如表1中所示。这表示大约18个胰岛的直径为150μm，或35,000β-细胞的体积。从38个不同的胰岛/胰腺试样?...

讨论

我们描述了一种可靠的方法，激光显微切割（LMD）的人类胰岛，胰腺手术标本。 ，一个LMD显微镜的，这个程序可以在任何研究机构进行部分胰脏，从而提高了进入人体胰岛材料从非糖尿病和2型糖尿病患者。缺乏所提供的胰腺的胰岛分离，这一点尤其重要。有利的方面，LMD通过胶原酶消化胰岛分离相比是减少外植的组织之间的时间和处理的胰岛的β细胞的富集^7，以及避免苛刻的机械和酶操...

材料

的试剂的名称	公司	目录编号	评论
2 - 甲基丁烷（异戊烷）	ROTH	3927.1
AdhesiveCap（不透明，500微升）	ZEISS	415190-9201-000
蜂星管（50毫升）	格赖纳生物一	210 261	撑裙
蜂星管（50毫升）	格赖纳生物一	227.261
焦碳酸二乙酯（DEPC）	SIGMA	ð5758
干冰
无水乙醇	VWR	20821.310
液氮
油漆刷
PALM微束	ZEISS
剥离的方式嵌入模具（截断），12×12毫米	ProSciTech	RR12	回内部22x22毫米，深度为21毫米
大角星PicoPure冷冻RNA提取试剂盒	美国应用生物系统公司	KIT 0204
塑料夹
剃刀
无RNA酶的DNA酶集	Qiagen公司	79254
RNaseZAP	SIGMA	ŕ2020
手术刀/手术刀片	TECHNO切	2800111
的Superfrost Plus粘连显微镜载玻片	Thermo Scientific的	J1800AMN​​Z	25x75x1.0毫米
组织康OCT化合物	樱花	4583或0807000022
镊子	BRAUN	BD168R
二甲苯	VWR	28975.291