对小鼠胰腺胰岛分离和细胞内cAMP的测定方法

摘要

含量测定采用胰岛分离的小鼠胰岛体外 β细胞功能是在糖尿病病理生理学和治疗学研究的一个重要组成部分。虽然许多下游应用的情况下，该协议特别描述作为必要参数确定的β-细胞功能的细胞内环磷酸腺苷（cAMP）的测定。

摘要

不受控制的高血糖是糖尿病的标志，并促进像神经病，肾病，视网膜病和发病率。患有糖尿病，这两种免疫介导1型和肥胖相关的2型，研究目的是区分糖尿病的病理生理和治疗机制的日益普及是至关重要的。 β-细胞朗格汉斯的胰岛负责适当地分泌胰岛素响应于升高的血糖浓度。除了葡萄糖等营养物质，β-细胞被特定的激素也刺激，称为肠促胰岛素，这是从肠道响应对β-细胞受体增产细胞内环磷酸腺苷一顿饭和行为分泌（ cAMP）的。减少β细胞的功能，质量和肠促胰岛素反应是很好理解有助于2型糖尿病的病理生理机制，并且也正在越来越紧密无线第1型糖尿病。本小鼠胰岛分离和cAMP测定的协议可以是一个工具，以帮助界定促进疾病进展和治疗干预，特别是那些由肠降血糖素受体介导的或相关的，通过细胞内cAMP产生的调制作用的受体机制。而仅cAMP的测量将要描述的，所描述的胰岛分离协议创建一个清洁制剂，其还允许在许多其他的下游应用，包括葡萄糖刺激的胰岛素分泌，[3 ^H] -胸苷掺入，蛋白质丰度，和mRNA的表达。

引言

严格的血糖正常的维护是必要的，以防止并发症如神经病，肾病，视网膜病变和，这是不受控制的1型和2型糖尿病¹的病理学的所有特点。减少β细胞功能和质量的1型和2型糖尿病扰乱血糖浓度^2。而从产生胰岛素的β细胞，受损的β-细胞分泌胰岛素，并在型外围胰岛素信号2型糖尿病的毁灭性损失免疫介导的1型糖尿病患者的结果一起促进高血糖，血脂异常，并增加肝葡萄糖生成，最终导致既损失的β-细胞质量和胰岛素分泌能力从个体β-细胞^3。理解在1型和2型糖尿病的进展相关的β-细胞的机制可望产生新的治疗，预防和治疗这些疾病。

体外 TISSUE培养模型，如INS-1和MIN6永生化的β-细胞系，可用于理解特定的β-细胞功能的有用工具。然而，在胰岛内的不同细胞类型的相互作用本身可调节β-细胞的功能。例如，胰高血糖素的旁分泌的影响（解除α-细胞）和生长抑素（从δ-细胞释放）的增加和减少胰岛素的分泌，分别展示了在内分泌反应^4芯电池接近的重要性。此外，β-细胞之间的间隙连接增强胰岛素⁵的释放。此外，虽然进步已在产生胰岛素线路，更好复制的分离胰岛的生理响应葡萄糖（ 例如 ，INS-1衍生十三 ​​分之八百三十二和3分之832细胞系），它们的葡萄糖响应性仍不同于正常大鼠胰岛^6,7。此外，这些克隆胰岛素瘤细胞系的反应以胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂可以从彼此显着不同，以及从正常胰岛^6。因此，永生化细胞系可能并不代表用于测定药物对cAMP生成的影响的最佳模式。

与此相反的胰岛来源的细胞系，仅在整体动物模型研究胰岛β细胞功能提供了它自己的一套并发症。其中与内分泌组织工作面临的最大挑战是测量激素的精确浓度释放。具体地说，肝起着重要的作用代谢胰岛素和胰腺的血流直接进入肝脏。因此，血浆胰岛素的测量可能不准确地描绘胰岛素从胰腺自身或不同处理对胰岛素分泌⁸的速率的影响被分泌的量。另外，胰高血糖素的肾代谢可能限制胰高血糖素输出的可靠度由胰岛α-细胞⁹。因此，初级分离小鼠胰岛体外实验提供了如何胰岛是响应特定刺激，以补充体内的测量结果更准确的理解。

本协议的小鼠胰岛的分离是通过使用一组数（有轻微的修改，可能有助于提高成功^）10,11行之有效的协议。另外，cAMP产生的确定允许直接读出的β-细胞的肠降血糖素应答性。与cAMP的测定，蛋白质含量和胰岛素分泌相结合，也可以从相同的cAMP的样品制备量化，帮助确定在β细胞功能的缺陷是否位于近端或远端的cAMP ^10。最后cAMP含量及在本协议中胰岛素分泌的应用程序可以是一个非常强大的工具，为了解医药和饮食成分的影响，其中包括秒，对cAMP和胰岛素分泌。除了 ​​刺激从单独的葡萄糖，其它的化合物可用于测量变化的cAMP和胰岛素分泌^10,11。

最后，虽然胰岛素是我们从分离胰岛，其他激素，如胰高血糖素和促生长素抑制素，以及细胞因子，类二十烷酸，和环磷酸腺苷测定的主要激素，也可以测量，无论是由瞬态刺激测定法或通过定量它们的含量在培养基^12。最后，虽然本手稿的范围之外，胰岛分离与所述胶原酶分离方法允许对胰岛保存，使得许多其它下游应用可以追求，如胰岛移植，RNA提取用于定量实时PCR或微阵列分析，蛋白隔离蛋白印迹，胰岛嵌入和免疫荧光成像，和[3H] - 胸苷掺入如胰岛细胞REPLI的量度阳离子，其中一些在前面的朱庇特的文章^13-16进行了描述。总体而言，继在协议中所述的胰岛分离过程中可提供研究者与开发的疗法，促进药物发现旨在提高胰岛β细胞功能的重要和有用的信息。

研究方案

所有动物实验均符合所有相关指引，法规和监管机构执行。威斯康星 - 麦迪逊大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导和批准下进行演示的协议。

1，准备解决方案

1. 安乐死在本协议的方法是放血下圣阿韦坦麻醉（替代品的审查，见讨论）。使圣阿韦坦，在15毫升锥形管和热加0.625克2-2-2三溴乙醇的（1.25％或44.2毫米）到1.25毫升2 - 甲基-2 - 丁醇，在37℃下进行20-30分钟。 VORTEX高10-15秒的解决方案在时间充分溶解2-2-2三溴乙醇。一旦完全溶解后，溶液加入到48.75双蒸H _{2 O}的毫升，用0.45微米的过滤器过滤到一个新的50毫升锥形管，包容量为50毫升锥形人管铝箔和储存在4℃可保存一个月。把管RT小鼠注射前。
2. 为了使Hanks平衡盐溶液（HBSS），补1升1X HBSS从10倍的股票（Gibco公司，Life Technologies公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）的双蒸H ₂ O，加入0.35克（4.2毫米）纳乔_3，和存储在4℃下长达1个月。对于每个鼠标，将需要胰岛分离105毫升此溶液（加5-10毫升额外的移液误差）。
3. 胰岛细胞很容易受到缺氧损伤;因此，HBSS鼓泡用95％O _{2/5％CO 2，}以模仿的O ₂的浓度在血液中。特殊气体混合物可以购买和冒泡站设置与连接到柔性管巴斯德吸管。鼓泡所需的HBSS中的量用95％O _{2/5％CO 2}中培养15分钟后，体积增加0.02％RIA级BSA（牛血清白蛋白），并保持在冰上的Remainder的胰岛分离的。
4. 用于制备聚蔗糖，称出32.5克Ficoll制备在一个400毫升烧杯中，加80毫升HBSS中，并搅拌以500-700 rpm离心30分钟。一旦溶解后，倒入聚蔗糖溶液倒入250毫升的量筒中，并加入HBSS中，以130 ml刻度上的量筒来创建一个25％的Ficoll溶液。覆盖量筒的封口膜®M（佩希内塑料包装公司，芝加哥，IL）两部分的顶部，大力摇晃几次。
5. 为23％，20.5％，和11％聚蔗糖溶液中，添加27.6，24.6，和13.2毫升25％聚蔗糖，分别到50毫升锥形管中。然后，把每个解决方案最多合共30毫升的HBSS，摇匀混合。所有四个聚蔗糖溶液应保存在4°C和有利于长达2周。
6. 胶原酶溶液，是适合用于分离活性胰岛从胶原酶梭菌分离制备histolyticUM（材料表）。每批需要对酶效率进行测试。通常，胶原酶是用在每毫升HBSS 0.3-0.5毫克。利用酶的浓度在该范围内（通常是3个不同的浓度），测定从年龄匹配的小鼠或窝设置工作的酶浓度分离胰岛的质量和数量。
7. 一旦正确的浓度是确定的，每个鼠​​标需要35毫升胶原酶在HBSS整个隔离协议。摇动胶原酶在HBSS中以使其溶解。紧接手术，预先加载一个5毫升注射器用胶原酶溶液，放置导管，并排除气泡，并且直到需要在冰上走。
8. 胰岛培养基为O / N培养是一个补充的RPMI 1640培养基。对于原液，在1升双蒸H _{2 O}的中溶解1 RPMI 1640包（Gibco公司，纽约），并添加1.19克HEPES（5毫米）和2克纳乔_3（24毫米）。将pH调节至7.4，过滤消毒，并在4℃下储存在黑暗中。
9. 用于补充培养基中，添加10％FBS和100 IU/100微克/毫升青霉素/链霉素，分别股价的RPMI 1640培养基中。如果使用不同的葡萄糖浓度是需要的，可使用葡萄糖的RPMI 1640培养基和葡萄糖的特定浓度可能会增加。
10. 对于一个股票的Krebs Ringer碳酸氢盐缓冲液（克雷布斯），添加以下成分，以蒸馏水在以下浓度增加一倍：氯化钠（118.41毫米），氯化钾（4.69毫米）， _硫酸镁 （1.18毫米），KH ₂ PO _4（1.18毫），NACHO _3（25毫摩尔），HEPES（5毫摩尔），和_氯化钙 （2.52毫摩尔）在pH为7.4。 _氯化钙应该是最后加入此溶液可以储存在4℃下长达2周。
11. 使克雷布斯，用95％的O _{一百八十二分之二} 5％CO ₂下10-15分钟内，用巴斯德移液管，在37℃，随后加入0.5％的放射免疫级BSA第一气体的工作原液（体积）。接着，葡萄糖加入到用于体外测定中所需的浓度。

2，准备工具

1. 稍钝的3​​0秘诀 - 使用27 G针一个磨石四舍五入的尖点。把一个45度的弯在大约一英寸的使用钳子从尖端¼针。注意不要挤压太硬，这将封闭针头的内径。
2. 切开3/0丝缝合线成约4英寸的长度，每一个鼠标。
3. 盖上保鲜膜，并带下来的解剖显微镜基地。
4. 切几件吸湿长凳纸，约3×5英寸的大小，为至少2％的小鼠。

3，准备鼠标

1. 填补1ml注射器用1毫升圣阿韦坦。
2. 腹膜内注射阿佛丁溶液在约40微升/克体重。
3. 鼠标没有升后的onger响应尾部或后足捏，小心地转移到解剖显微镜工作站。
4. 用鼠标在仰卧位和它的头对着远端，喷鼠标用70％乙醇水溶液。一定要使用70％乙醇适量，以限制暴露胸腔毛皮的数量。

4，打开胸腔

1. 捏住两后肢之间的鼠标的皮毛和皮肤，透过表皮，真皮​​和底层膜进行初步切割。
2. 虽然仍挟捏肌肤及相关膜，切向的鼠标照顾，以避免削减任何内部器官两侧的前翼。
3. 折叠的皮肤和膜瓣在胸腔，取出剑突，让胰腺通货膨胀更容易获得。
4. 重新调整鼠标与头部朝向近侧移动内脏朝向工件的右侧ST通报BULLETIN揭示降主动脉。
5. 除非血液组织要收集，降主动脉可切割完成安乐死。吸收过量的血液与工作台纸或Kimwipe擦拭至胆总管更容易获得。

5，充气胰腺

1. 用解剖显微镜，重新定位在小肠这样胆总管形成用鼠标的头部的垂直线。
2. 取一个镊子和把握小肠和发现胆道口括约肌（壶腹括约肌）在胆总管，其中分叉是通往从胆管小肠，形成白色三角形上的粉红色肠的末端。一旦奥狄括约肌已经找到，采取＃5杜蒙钳和滑动笔尖胆总管尽量靠近小肠尽可能下方，小心不要刺破管。
3. 通过小肠和结缔组织穿孔后，使用杜蒙的尖镊子把握缝合和下胆总管拉。打结胆总管接近奥迪氏括约肌的可能，确保结拉紧，以防止泄漏。
4. 抓住缝线的两端拉向尾部放一些紧张的胆总管。使用放开手脚，做一个小切口正上方的最后一个分叉进入肝脏的胆管微剪刀。注意：不要切得太接近奥狄括约肌，因为这可能会导致胰腺的局部通货膨胀和避免因胆总管切，因为它也将导致在一个贫穷的通货膨胀是很重要的。
5. 按住弦的两端与胆总管绷紧，取出注射器/套管已经预装了从冰桶5毫升胶原酶溶液，放下注射器，然后将减弱30 G针头插入切胆总管，小心不要通过WA刺破LL导管。如果30号针头不够宽的胆管周围形成密封，将其删除并替换为减弱27号针头。
6. 而持针到位，松开缝线，拿起5毫升注射器的。慢慢压下注射器的柱塞。注意：如果针头已成功插入胆总管，这将扩大。
7. 继续压低柱塞慢慢地和以脉动的方式让关闭，直到胰腺的第一部分膨胀，接着温和恒压直到胰腺不再膨胀。注意：大多数胰腺持有3-5毫升开始泄漏之前。此外，一个成功的通货膨胀将具有均匀分布的外分泌组织和对胃的顶部胰腺的部分会膨胀。
8. 从胆总管取出针，掀起了一边。

6。胰腺去除

1. 就拿镊子，一手在弯剪另一个。使用镊子，把握小肠在奥狄括约肌。用剪刀闭合时，用笔尖从小肠，胰腺的单独部分。
2. 传播剪刀拆开来扩大小肠和胰腺之间的差距。
3. 放置在小肠和胰脏彼此附接在刚建立的间隙的右侧的剪刀的“V”形。使用镊子轻轻拉出小肠过去剪刀去除胰腺。
4. 坚持工作下移小肠，以粉红色的结缔组织。在这一点上，拿起不远的地方，它附着于胃小肠和剪断胰腺远离小肠的其余部分。注意：小心不要剪断胰腺，因为它可能会开始紧缩。
5. 轻轻抓住连接到与钳（平头镊子工作最好）胃胰腺的一部分。而在胰腺轻轻向上提拉，使用曲线ð剪刀剪断了在胰腺和胃之间的连接。
6. 找到脾脏，并与上述胰腺镊子持有它。就拿弯剪刀切去脾脏和胰腺之间的连接。
7. 发现其中胰腺附着到大肠。拿起大肠钳，并使用剪刀的尖端捅。如之前传播剪刀分开，以产生大肠和胰腺之间的间隙。
8. 托起大肠用钳子：​​这将导致胰腺落下去，露出到大肠其精确的连接。喀嚓掉剩余的连接。
9. 发现附着在胰腺和小肠中的粉红色结缔组织和切割尽可能靠近胰腺越好。注意：如果刺入胰腺是一个问题，它是表示削减接近小肠的结缔组织，将过滤掉在后面的步骤。
10. ĞRAB尽可能多的胰腺越好，然后将其轻轻地。用弯剪，剪去胰腺和胸腔之间的剩余连接至完全消除胰腺。注：如果去掉正确的胰腺仍应被夸大。
11. 储存在约2.5毫升的胶原酶溶液中取出胰腺在50ml锥形管中在冰上，直到所有其他胰腺已经膨胀并去除实验。

7，洗涤

1. 采取一切胰腺中分离，并移动它们分开50ml锥形管中各含25毫升新鲜胶原酶溶液
2. 放置在50ml锥形管直立于37℃振荡水浴中振荡能在220-250转，用振动筛关闭。
3. 气各50毫升锥形管中以95％O _{2/5％CO 2}为5分钟内，用巴斯德移液管。
4. 回顾一下各管紧密，横着放置在水中晃动水的表面下方浴。摇在220-250转20秒，每隔一分钟，最多16分钟开始分6。（摇6，8，10，12，14和16分钟）
5. 紧接在管转移至离心分离机在常温下进行快速自旋。把离心机高达1500转（400-500克），并立即关闭。
6. 使用真空捕集，吸22.5毫升的胶原酶溶液中，而不会干扰沉淀。用10毫升的HBSS和涡轻轻地洗，打破了沉淀。
7. 在室温下进行另一次快速旋转可达1500转（400-500克）。
8. 吸出约10ml的溶液，再次不干扰沉淀。
9. 与另一10ml冰冷的HBSS和涡轻轻地洗，再次打破了沉淀。重复的快速旋转和吸出的10ml溶液中。
10. 轻轻涡旋将沉淀在剩余的加入2.5ml的HBSS溶液。通过倒的解决方案1,000微米网眼进入一个新的50ml锥形管中。这将删除不被胶原酶消化了大量的组织碎片。
11. 冲洗旧50ml锥形管中加入2.5ml冰冷的HBSS中。用巴斯德吸管通过网状传送2.5毫升的HBSS到新的50ml锥形管中之前，彻底地冲洗该管的侧面。
12. 在室温下进行另一次快速旋转以1,500 rpm（400-500克），以沉淀组织。
13. 通过倾斜管向真空吸陷阱所有的HBSS。注意：不要打扰颗粒，因为这将导致胰岛的损失是很重要的。如果颗粒松动或开始走向真空陷阱，停止抽吸液和再生颗粒的组织，然后继续吸出剩余的溶液。
14. 一旦所有的HBSS中已被删除，添加4.8毫升25％聚蔗糖溶液和涡流打散沉淀。
15. 仔细层2.4毫升2通过添加23％的Ficoll溶液到50ml锥形管中的侧上的25％的Ficoll溶液的顶部3％的Ficoll溶液。以确保均匀分层，加入聚蔗糖溶液时旋转50ml锥形管中。
16. 重复的分层过程20.5％，然后11％聚蔗糖的解决方案。注意：如果4个不同的层不存在，请添加HBSS了容量为50毫升标记和颠倒离心管4-6次，或直至聚蔗糖梯度不再存在。再生颗粒的组织，然后重试步骤,7.14-7 .16。
17. 旋转的50ml锥形管中在室温下在1820转（800 g）关于15分钟。
18. 倒入所有的聚蔗糖进入新的50ml离心管中，小心地离开外分泌组织的颗粒后面。加入冰冷的HBSS了容量为50毫升标记和颠倒离心管4-6次混合的聚蔗糖和HBSS在一起。
19. 旋转的50ml锥形管中在室温下在1820转（800 g）关于5分钟。
20. 使用真空TRA小心吸大多数的HBSS /聚蔗糖混合物的页。请勿打扰颗粒，因为它是松散的，很容易被吸出。
21. 采取巴斯德吸管将沉淀转移到一次性培养管中。

8，采摘胰岛

1. 加入5 ml采摘媒体（ 即 。补充的RPMI 1640或克雷布斯Ringer碳酸氢盐缓冲液）的一次性培养管。注意：拾取介质将取决于下游应用而有所不同。
2. 让胰岛沉降到培养管中进行5分钟的底部。使用巴斯德移液管至15毫米的由60毫米聚苯乙烯培养皿传送。注意：使用的培养皿中，因为这些都是不治疗，并防止胰岛附着在盘是很重要的。
3. 在一个单独的15毫米由60毫米聚苯乙烯培养皿中，加入5 ml小鼠胰岛培养基（100毫升RPMI 1640证券媒体，将10毫升热灭活FBS 1毫升青霉素/链霉素;过滤消毒）。
4. 用解剖显微镜用backlig的协助HT功能，使用P-20吸管挑胰岛成含有胰岛培养基的培养皿中，同时注意避免转移腺泡组织碎片。当背光，小岛将出现棕金及其外膜可以闪亮，而腺泡组织会出现浅灰色和沉闷。如果胰岛制备含有大量的碎片，最好是手动挑选胰岛两次到新鲜培养基中。过夜培养后减少碎片的污染将限制胰岛结块。加入DNA酶（3,000单位/毫升）的消化缓冲液也可能有助于限制胰岛聚集（何礼，个人观察）。注意：给计数的胰岛分离规划下游实验的数量是很重要的。
5. 孵育胰岛O / N在孵化器设定为_{37℃，5％CO2。}

9。cAMP的含量

1. 标签1.7毫升微量离心管，一个用于测定每个重复。注：cAMP的检测至少应该有杜plicates每个处理条件，但每处理重复更是首选。
2. 用95％O _{2/5％CO 2}的巴斯德移液管放气克雷伯氏Ringer碳酸氢盐缓冲液15分钟后，加入0.5％的放射免疫级BSA，并最终葡萄糖的1.7毫米（预培养溶液）的浓度。然后，加入1毫升新鲜毒气克雷布斯到每个离心管中。两毫升​​克雷布斯每管所需的预培养和处理时间点;但是建议至少准备5〜10毫升的额外费用。
3. 漩涡胰岛到培养皿的中央，并用P-20移液管，由含有5ml的预培养液洗涤含有葡萄糖的培养基中60毫米聚苯乙烯培养皿手工挑选胰岛到一个新的15毫米从小岛。
4. 所使用的cAMP测定试剂盒是GE医疗的cAMP直接BioTrak环境影响评估。所用的prococol是，对于“内cAMP测量所述变形使用非乙酰化EIA方法与新颖的裂解试剂“，并urement已被优化以每管胰岛的最小数目的使用，允许的处理条件和技术重复数量增加。使用P-20移液管，移至少13胰岛到每个管中从步骤9.2，保持管之间的胰岛的大小一致，用1ml预孵育缓冲液中。注意：增加重复数比每管胰岛的数量更为有利。但是，如果有足够的胰岛细胞，以增加每管胰岛的数量均匀，最好是这样做的，最多每管25-50的胰岛。
5. 用微量离心管盖打开时，转移到37℃培养箱设定为5％CO ₂孵育45分钟，以归一化所有的胰岛的胰岛素分泌至基线水平。
6. 而样品孵化，在毒气克雷布斯神父准备处理（ 即 8毫米，11.1毫米，16.7毫米葡萄糖等）OM步骤9.2。在15毫升锥形管，用1 ml额外占到任何移液错误。添加3 - 异丁基-1 - 甲基黄嘌呤（IBMX），以200μM的最终浓度。 IBMX是一个普通的磷酸二酯酶抑制剂，阻止cAMP的降解，使cAMP的积累在细胞中，因为它被生产。 （注：这是一个真正的cAMP生成分析见讨论部分的情况下，当测量cAMP的产生可能不是可取的，如果IBMX被排除在实验中，更多的小岛将被要求每管，以获得在营中的数据标准曲线的线性范围内）。
7. 在45分钟预孵育后，从孵化器中，帽和脉冲涡流每个样品（小于0.5秒）除去微量离心管中。这是混合起来，已可能已经产生由于胰岛细胞被集中在管的底部的胰岛素梯度。必须注意不要剧烈振荡过于严厉，因为这可能胰岛稳定度（注产生负面影响：封顶管与胰岛可轻轻弹或倒置，如果这是不可能到脉冲涡流平缓。这些选项会增加时间的检验，应规划实验时，应考虑）。
8. 每管转移到台式离心机（RT）和旋转，直到小岛达到10000转（7,000-7500克），然后立即关闭。
9. 使用P-1000移液管，以除去大部分的Krebs在每个离心管中，留下约10-15微升的Krebs对胰岛沉淀。使用P-20移液管以除去部分最接近的胰岛沉淀。如果小球受到干扰，吸取克雷布斯放回管和返工。
   （注：如果实验者发现它太难以从胰岛沉淀除去所有的克雷布斯的，而不会干扰它，过去的10-15微升可能会留在并在总体积后，在协议占。
10. 获得在一个绝缘容器捕捉冻结的样品温育后，液态氮的足够量。
11. 取样品出培养箱，帽，涡流迅速（小于0.5秒）旋在台式离心机（RT）高达10,000转（7,000-7500 g）中，离心管，然后立即关闭。如果胰岛素或其他代谢产物是所期望的下游应用中，使用P-1000移液器收集培养基的等分试样在微量离心管中并储存在-20℃直至进一步分析。如果没有被收集的刺激媒体，它可能被丢弃。
    （注：IBMX是葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS强烈的增效剂），因此，从刺激的cAMP介质获得GSIS结果可能不能准确地代表特定处理对GSIS的真实效果，尤其是如果这些影响是微妙的。）。
12. 重复步骤9.9删除尽可能多的刺激中等尽可能不干扰胰岛沉淀。急速冷冻胰岛沉淀在液氮中一旦有低于10-15微升克雷布斯的留在胰岛沉淀。一旦所有的样品已迅速冷冻，储存在-80°C，直到cAMP的测量。
13. 对cAMP的测定当天，根据制造商的协议，准备在新的裂解试剂。添加200毫升裂解试剂1B到每个离心管，涡旋以最快的速度，持续30秒。让管坐于冰上10分钟，涡旋每2分钟30秒。 （注：该协议建议进行微观分析，用锥虫蓝，以确保细胞溶解，但这并不是对胰岛进行的）。
14. 准备工作标准，并成立了环评微孔板完全按照厂商说明。后的酶底物已被孵育微孔板30分钟，执行选择性的1.0M硫酸步骤，并确定该微板孔中的吸光度在450nm处用酶标仪。
15. 环磷酸腺苷的结果将被记录为fmol /孔。这应被归一化到原始样品的总体积（200μL+任何剩余克雷布斯留在步骤9.9的小岛）。接着，结果可以被归一化到胰岛的总数量，使fmol的cAMP的产生/胰岛，或裂解物的样品可经受二喹啉甲酸（BCA）蛋白测定的结果归一化至总细胞蛋白（施与fmol的子/μg蛋白） 。后者时，建议胰岛的大小是样品间的不一致，并且可以替代为胰岛的大小。皮尔斯BCA蛋白测定试剂盒已被用于在该协议的成功，并要求只有25毫升的样品。 BSA的标准应在裂解试剂1B的cAMP测定试剂盒准备。

结果

为了确保隔离在一个高胰岛产量，在协议中所概述的手术技术应密切随访。虽然这里介绍的技术将针对每个实验室有，这将导致一个成功隔离了几个关键步骤。为了使胆总管方便，所以建议的器官被移位到右侧的鼠标（ 图1）。此外，这将使胰腺膨胀以较小的阻力，因为会有较少的重量限制了业务发展。另一个关键步骤，以最大限度地提高胰岛产量胆总管接近奥狄括约肌（ 图2A-...

讨论

糖尿病患者预计将影响到世界人口的7.7％的患病率，新颖的研究方法的要求是必须既认识和对待糖尿病^18。目前胰岛分离是用于体外实验完善的协议，并已稍作修改^11,14,16以前提出。虽然胰岛素分泌的胰岛共同的下游应用，专注于上游的成分，如环磷酸腺苷，可以帮助划定增效胰岛素的产生和分泌的机制。

安乐死的选择必须作出深思熟虑，以确保双方的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets	Sigma-Aldrich	C7657
Ficoll 400	Sigma-Aldrich	F9378
Hanks Balanced Salt Solution 10X	Invitrogen (Gibco)	14065-056
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
RPMI 1640 (powder)	Invitrogen (Gibco)	31800-022
Albumin from Bovine Serum (BSA)	Sigma-Aldrich	A7888
3/0 Silk Suture Thread	Fine Science Tools	18020-30
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10
0.8 mm Forceps	Fine Science Tools	11050-10
Curved Scissors	Fine Science Tools	14061-10
Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15003-08
Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14002-14
5 ml BD Luer-Lok Syringe	BD	309646
1 ml BD syringe	BD	309628
30 G BD Needle 1/2" Length	BD	305106
27 G BD Needle 1/2" Length	BD	305109
Sharpening Stone	Fine Science Tools	29008-01
2-2-2-tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25G
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486-100mL
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Monopotassium Phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium Bicarbonate (NaCHO3)	Sigma-Aldrich	S6014
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881
MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M9397
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen (Gibco)	15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS)	Fisher Scientific	SH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma-Aldrich	5879-100MG