自由基化学生物学的化学行为，生物标记开发

摘要

自由基基于仿生化学已被应用到建筑物库所需的生物标志物的发展。

摘要

随着时间的推移不断增加的自由基生命科学的参与，并已连接到多种生理和病理过程。这个主题包含了不同的科学领域，包括物理，生物和生物有机化学，生物学和医学上的应用程序的生命，健康和老龄化的质量的改善，。多学科的技能都需要在充分调查的激进过程的许多方面环境的生物和化学知识在公布的基本过程和机制中起着至关重要的作用。我们开发出一种化学生物学的方法能够连接自由基化学反应的生物过程，机制的途径和产品的信息。这种方法的核心是设计的仿生模型来研究生物分子的行为（脂类，核酸和蛋白质），在水性体系中，获得的见解的反应途径，以及一个S大厦的自由基的反应产物的分子库。此范围内可成功地用于生物标志物发现，实施例中所提供的两个类的化合物：单 - 反式异构体的胆甾醇酯，其中的合成和使用用于检测人血浆中的参考，和嘌呤5'-1,8 - 环-2 ' - 脱氧核糖​​，准备在这种病变的DNA样本中检测的协议作为参考使用，经过电离辐射或者获得不同的健康状况。

引言

自由基的反应显示其巨大的重要性，许多生物的活动，包括老龄化和炎症。如今，它是越来越明显，每个参与此反应的化学步骤是必要的澄清，以了解底层机制和设想有效的战略控制的自由基，修复的损坏。从化学研究的贡献是根本，但在生物环境中可以直接研究是困难的，因为不同的进程复杂化的叠加扰动检查的结果及相关结论。因此，战略模拟生物相关条件下的自由基反应，在生物学的化学机制的研究已成为一个基本步骤。

在过去的十年，我们的小组研制仿生条件下的自由基过程的模型。特别是，我们EN面孔的不饱和脂肪酸，核苷和含硫氨基酸的生物相关的转换，在轨道上，并把它们作为生物标志物的健康状况进行评估和验证^。1-4

我们一般的做法是由三个模块组成：

• 有机合成，它提供了访问到适当修改的生物分子。合成的计划也可以设计以模拟在生物环境产生的自由基过程，因此适用条件，能够模拟生物过程的原则，仿生自由基化学的兴趣，这是。在仿生模型的反应介质是水或异构的介质，由于共存的亲水性和疏水性的舱室。与仿生模型的优点是有一个简化的环境，可能与已知反应的合作伙伴，反应性和产品的详细信息，可以检查发现新的化学途径。从这个步骤可以收集机制和动力学信息;
• 纯化，分析和鉴定的产品，提供修改后的生物分子结构和化学信息，以组织分子库和促进recognition.in更复杂的生物环境。协议被建立也鉴于解决复杂的混合物的化合物，如那些衍生自生物样本;
• 使用衍生的生物样品，可以通过在体外实验中使用的细胞培养，并从动物和人类体内研究的生物标志物的发展。仿生模型开发的协议，然后应用到复杂的分析样品，在不同的条件下设想自由基变换。分子库开发的合成，是生命科学的发现有很大的帮助。收集到的信息的自由的根本转变GIVe的机会，修复和预防战略。仔细评估的结果可用于数据库的生物标志物的意义以及可能的相关因素的多因素分析。

我们选择了两个类相关的生物标记认可这样的做法：胆甾醇酯和嘌呤5',8-环-2'-脱氧核糖核苷。

研究方案

1。单声道 - 反式异构体的胆甾醇酯的合成

1. 溶解的胆甾醇酯（亚油酸或花生四烯酸胆固醇酯）在2 - 丙醇（15毫摩尔）。为了更好的增溶，将样品超声处理15分钟，在氩气下。
2. 将该溶液转移到石英光化学反应器中，添加2 - 巯基乙醇，2 - 丙醇（达到700 mM的浓度，从一个2 M原液的硫醇）。为了消除溶液中的氧的存在下，20分钟，将反应混合物用氩气冲洗。
3. 照射反应混合物中使用5.5W的低压汞灯的UV光，在22±2℃下进行4分钟。监控的银银薄层色谱法（TLC）分析的证据的单-反的胆甾醇酯的形成（参见图1的化学式）。的TLC染色进行浇注板铈铵molibdate（CAM）的溶液中，并出现斑点在加热板。在早期阶段，淬灭反应，为了回收的起始原料，可以重复使用，以执行其他轮的异构化，得到的总产率增加。
4. 收集的反应混合物在一个圆底烧瓶中，用几毫升的2 - 丙醇洗涤装置。除去溶剂，纯化单-胆甾醇酯的反式异构体，如在文献中描述的由^Ag-TLC。5使用己烷-乙醚（9:1 V / V）作为洗脱剂为单-反式胆甾醇亚油酸酯的异构体，而使用己烷 - 乙醚 - 乙酸（9:1:0,1体积/体积）为单 - 反式胆甾醇花生四烯酸酯的异构体。

2。人血清胆固醇酯组分分离

1. 稀释1毫升人血清（的血液通过离心分离得到的），用1毫升盐水洗涤，并倒入到一个分液漏斗中的溶液在氩气气流下，为了避免工件（ 例如氧化加合物）。加入10毫升氯仿 - 甲醇（2：1 V / V）三次。摇动分液漏斗中非常缓慢，以限制由于白蛋白存在下形成的乳液。
2. 一次，用盐水（10ml）洗涤有机层，然后收集在锥形烧瓶中在氩气流下，干燥，用无水硫酸钠干燥。用旋转蒸发器除去挥发物，得到黄色油状物（血浆总脂质成分）。
3. 占用的粗品，用1毫升氯仿 - 甲醇（2:1体积/体积），在氩气气流下负载到制备TLC并用己烷 - 乙醚（9:1体积/体积）的混合物作为洗脱剂。刮去硅胶部分含有胆固醇酯组分，倒入一小瓶。然后，提取的二氧化硅（3×5毫升），用氯仿 - 甲醇（2:1体积/体积）中，收集的有机层，除去溶剂蒸发后，得到的胆甾醇酯（通常是在〜1.5毫克）的纯馏分。
4. 查看由铝箔覆盖于-20℃下在氩气下和存储在一个黑暗的小瓶的胆甾醇酯胆固醇Ë光线和氧气sters敏感的。

3。单跨胆固醇酯的拉曼光谱表征

1. 提取从人血清（≥0.7毫克），如在第2条中所述的胆甾醇酯，溶解于少量的四氯化碳（≤10微升）和在小瓶中。 CCl _4中被选择作为溶剂，因为它的拉曼信号与胆固醇酯的分析感兴趣的区域不重叠。
2. 将该溶液转移到样本保持器通过一次性玻璃吸管，然后小心地除去溶剂，由缓慢的氩气流中。一旦形成均匀的油膜的样本保持器的内壁上，后者放置到仪器进行测量。
3. 傅里叶变换拉曼光谱上直接获得的胆甾醇酯的脂质提取物，没有任何衍生反应。样品上的激光功率是<100毫瓦，以避免样品的损害。的总的扫描数为每个频谱为≥800，以最大限度地减少背景噪音。
4. 1,700-1,630厘米^-1范围内的拉曼光谱进行了分析，从C = C双键的分子（C = C伸缩振动模式），因为它反映了贡献。甲进行曲线拟合分析该区域中，从而允许区分中的脂肪酸的烷基链和双键中胆固醇（参见图2）的B环的顺式和反式双键的叠加的贡献。
5. 为了适应正常的振动带，一些参数应该是固定的，或限制在合理的范围内。的组分峰公司被描述为洛伦兹和高斯函数的线性组合，而在半高带宽最好是由计算机确定的优化例程。的组分峰的数目和位置的，得到通过使用第四微分光谱，这允许检测也有一些微弱的单位频带。由于信号信噪比劣化后，分化的信号可以排除使用第四衍生物，平滑第四衍生物，具有13点Savitsky-格雷（Golay）功能，有优势，因此，一个合适的分辨率和信噪比之间的妥协得到。在尽可能低的c ²值获得最佳曲线拟合。
6. 反式异构体的存在下，发现由该组件在1671±1cm ^-1处 ，此外，至少两种组分，稍移向较低的频率，由于脂肪酸链和胆固醇的C = C双键。血浆胆甾醇酯的代表性的拉曼光谱示于图9。在插图中示出与胆甾醇亚油酸酯和单 - 反式胆甾醇亚油酸异构体的特定区域的比较。

4。衍生脂肪酸甲酯（FAME）和气相色谱分析

1. 溶解胆甾醇酯（〜1.5毫克），用0.5毫升的1M氢氧化钠溶液中，苯 - 甲醇（2:3体积/体积）和地点所涵盖的铝箔在氩气下在一个黑暗的小瓶中。
2. 保持该混合物在搅拌下于室温，并用TLC显示器用己烷 - 乙醚（9:1体积/体积）的混合物作为洗脱剂。反应时间通常是30分钟但仔细的反应监测需要。事实上，一旦形成相应的甲基酯，该反应必须被骤冷，以避免降解和副产物的形成。 TLC表明甲基酯的定量生成。
3. 淬灭反应混合物，通过添加1毫升的盐水洗涤，并提取与n-己烷（3×2毫升）的甲基酯。收集的有机层到小瓶中，并通过旋转蒸发除去溶剂，得到的甲基酯的馏分，然后将其不经进一步纯化用于GC分析。
4. 的甲基酯溶解在n-己烷的最小量的（通常为1毫克，5个0微升）和注入的60米×0.25毫米×0.25微米（50％ - 氰基丙基） - 甲基聚硅氧烷柱配备在GC。使用氢火焰离子化检测器（FID），以下烤箱计划：在165°C的低温启动，保持3分钟，增加1°C /分钟高达195°C，持续40分钟，随后的第二增加为10°C / min升温至240℃，保持10分钟。选择一个恒压模式（29 PSI）。氦气或氢气作为载气，可以使用。甲基酯比较，与真实样品的保留时间确定的， 图10示出了代表性的GC分析，获得的血浆胆甾醇酯的FAME。

5。合成（5'R） - 和（5'S）-5'-1,8 - 环-2'-脱氧腺苷

1. 将33毫克的8 - 溴-2'-脱氧腺苷（8 - 溴-墙裙）的乙腈（100毫升）溶解，以达到浓度为1mM。在光催化反应器，调节气体流量（Ar或N2），填补了瑞星千克基本与8 - 溴-墙裙溶液。
2. 准备一个隔垫适当大小的光反应器的输入，并通过连接到惰性气体通过它的中心的线的针。关闭系统的隔膜。的惰性气体进行冲洗30分钟。
3. 通过UV光的照射，使用125W中压汞灯，在22±2℃下进行15分钟，收集到一个250毫升的圆底烧瓶中的溶液。 10毫升乙腈和洗净的光催化反应器，在相同的烧瓶收集洗涤。
4. 淬火的粗反应混合物用1M NH ₄ OH溶液，并在旋转蒸发器中蒸发掉溶剂。
5. 在已知的条件下运行的高效液相色谱分析法（HPLC-UV）分析柱（见插装部分），并比较参照化合物的档案。
6. 运行高性能液相色谱分析（HPLC-UV）用分析柱（见插装部分），通过使用以下的溶胶喷口和梯度：2 mM的甲酸铵作为溶剂A和乙腈作为溶剂B设定流速为1毫升/分钟，要达到在2.2分钟的梯度从0％溶剂B，0.3％溶剂B。 0.8％的溶剂B在4.0分钟，4.8分钟1％溶液中的B。维持在1％的溶剂B为9分，然后在6分钟到8％溶剂B。在4分钟到10％溶剂B，30％溶剂B中5分钟，并保持在30％溶剂B，其他5分钟后。收集对应于在两个不同的小瓶中的两个非对映体产物的色谱峰。
7. 两个收集的馏分在紫外分光光度计测量吸光度和计算是以Lamber-Beer定律（A =εlC，其中A为吸光度，ε的消光系数和升细胞的长度）的基础上的准确浓度。使用2'-脱氧腺苷（墙裙）（15,400 M ^-1厘米^-1在260 nm）的消光系数ε。

6。合成（5'R） -D（5'S）-5'-1,8 - 环-2'-脱氧鸟苷

1. 为了达到1mM和2mM浓度，分别将35毫克的8 - 溴-2'-脱氧鸟苷（8 - 溴-dGuo）在蒸馏水（100毫升）和30毫克的碘化钠（NaI）溶解。规管的惰性气体（Ar或N _2）连接到的光反应器的流和填充的光反应器与反应溶液。
2. Degass程序5（步骤b）中所描述的反应混合物。
3. 通过UV光的照射，使用125W中压汞灯，在22±2℃30分钟，收集到250毫升圆底烧瓶中加入该溶液。用10ml的水和洗净的光反应器中的相同的烧瓶中收集洗液。
4. 骤冷的粗反应混合物用1M NH ₄ OH溶液，并在真空下蒸除溶剂。
5. 中描述的步骤5（步骤E至G）进行分析。使用2'-脱氧鸟苷（dGuo）（11,700 M ^-1厘米^-1在260 nm）的消光系数ε。

7。合成的同位素标记的嘌呤（5'R） - 和（5'S）-5'-1,8 - cyclonucleosides

1. 准备2毫升1mM的水溶液（蒸馏水^），15 N同位素标记的嘌呤核苷（[15N ^5] DADO或[15N ^5] dGuo）用隔膜帽（4毫升）在玻璃样品瓶中。
2. 小瓶用的隔膜帽连接，并连接到通过气体管线（N _{2 O的}溶液的饱和度），到达底部的小瓶中的隔垫的针。在隔垫盖的另一个短针作为气体出口。
3. 冲洗30分钟，该溶液与N _{2 O。}的气体流量调节是非常低的。
4. 首先退出针取出后1'的长1如下，以便有一个小的内部压力小瓶。
5. 8小时（计算的基础上的剂量率约4.5戈瑞/分），将溶液中的装置的伽马辐。
6. 反应后骤冷的粗品，用1M NH ₄ OH的解决方案。
7. 已知的条件下^，6运行高性能液相色谱分析（HPLC-UV）和比较色谱图与标准的参考文献。

8。 DNA水溶液中的伽玛辐

1. 准备1毫升0.5毫克/毫升的小牛胸腺DNA的溶液（蒸馏水）中，在一个玻璃小瓶（2毫升），并把用隔膜帽。
2. Degass反应步骤7中描述的（步骤BD）。
3. 将溶液中的γ辐解装置30分钟（计算剂量/速率约4.5戈瑞/分的基础上）。

9。酶消化DNA

1. 含有80微克的DNA到Eppendorf管中，添加8 U的核酸酶P1，0.01 U的磷酸二酯酶Ⅱ，300 mM乙酸钠（pH 5.6）中和10 mM的氯化锌在20微升20 nmol的EHNA。将混合物在37℃下孵育48小时。
2. 接下来，添加8 U碱性磷酸酶的混合物，0.02 U phosphodiesterase口，在40微升的0.5M的Tris-HCl缓冲液（pH值8.9）中的混合物的消化。将样品在37℃下孵育2小时。
3. 通过加入10％甲酸中的混合物。
4. 转移的Amicon Ultra-0.5离心过滤装置（截止3 kDa）的样品，加入200μltridistilled H _{2 O}在14,000 xg离心15分钟将设过滤器进入离心机转子。超过滤装置离心管，然后分开。在离心管，冷冻干燥的酶的解决方案。

10。在此之前分析的DNA样品脱盐

1. 运行高效液相色谱分析法（HPLC-UV）分析柱（见插装部分）的已知条件^。
2. 冻干消化的DNA溶解在20μl的H _{2 O}中，并注入HPLC-UV。
3. 收集样品后，一小瓶盐洗脱（第一分钟）和前洗脱添e的第一核苷（5'R-cdGuo），，直到色谱节目结束。
4. 将样品冻干20μl水resolubilized中。

11。 LC-MS/MS定量分析

1. 准备的的HPLC-MS/MS（三重四极杆）之前加载的分析方法和MS检测方法（ESI）开始分析。
2. 在程序7中制备的样品中的同位素标记的化合物的混合物中加入1μl。
3. 注入20微升消化的DNA溶液在蒸馏水中加标。
4. 以前的校准参照化合物的基础上，得到的色谱数据进行了阐述。一位代表HPLC运行含有腺苷，鸟苷2'-脱氧核糖核苷和它们的氧化和环衍生物， 如图11所示。

结果

特别是得到的亚油酸和花生四烯酸的单-反式异构体在图1中所示，作为这种攻击的第一个产品，它可以发生自由基应力的条件下，在生物环境中的胆甾醇酯的异构化反应过程中已被描述^。

在图3中示出的顺式-反式的双键异构化中涉及的化学机制。激进的源显示在一个通用的方法来负担S-为中心的自由基。在所描述的协议的自由基源是UV光，是能够打破homolitically SH键中存在的硫醇分子RSH的。

图4总结了协议，用于合成的改性的脂质类和它们的检测人血浆中的三个步骤：在合成代表仿生自由基的过程，而且还提供了一锅煮的方便的入口的GEOMETrical的同分异构体，位置异构体没有任何污染随后纯化和分离协议。

几种分析方法可以应用于一种高灵敏度检测的反式异构体的含量和表征的单 - 反式胆固醇酯图书馆。特别是，可以进行拉曼光谱上直接非衍生化的胆甾醇酯馏分（参见图2和图9）。

第二个例子涉及嘌呤5'-1,8 - 环-2'-脱氧核糖核苷，这是创建的DNA损伤的自由基攻击的位置C5'的糖部分和随后形成一个共价键之间的糖和碱部分。可以产生四种结构，即，5'-1,8 -环-2' -脱氧腺苷和5'-1,8 -环-2' -脱氧鸟苷，现有在5'R和5'S非对映异构体的形式（ 图5）。在图6吨中他的反应机理示出，涉及5的8 bromopurine衍生物光解，得到相应的C8自由基6，该分子内抽象从C5的位置选择性地，得到的2'-deoxyadenosin-5'-基的自由基7为氢原子。自由基7进行环化反应的速率常数的范围为10 ⁵ -10 ^{6 -1，2，}然后通过氧化的杂芳族基团8，以使最终产品⁹中。羟基自由基的反应，所产生的辐解水，用2'-脱氧腺苷，2'-脱氧鸟苷（10），发现发生约。 10％的氢抽象C5'的位置。

我们的化学生物学方法图书馆嘌呤5'-1,8 -环-2'-脱氧核糖核苷（包括标记的化合物）中示出在图7中，与这些病变在寡核苷酸的识别，以及在获得的DNA样品从弗吉尼亚州rious源，例如，例如，在电离辐射的条件下，处理，作为模仿自由基的应力条件。

在图8中示出一个典型的光反应器设备。该装置允许在适当的溶剂中溶解的化合物的照射。它包括：i）在反应腔室的入口为惰性气体（在底部）和气体出口的两个入口和试剂此外配备;ⅱ）含有适当的水银灯的一个内部腔室的冷却系统连接和电功率，其被插入到反应室，通过一个玻璃接头。

图1。单-反式异构体的，胆固醇亚油酸和花生四烯酸。

图2。胆甾醇酯在人血清和直接分析为单-反式异构体的拉曼光谱。

图3。加成-消除过程，导致双键的顺反异构化，生成硫中心自由基。

图4。三个步骤协议开发的单跨胆固醇酯作为生物标志物自由基的压力。

图5。四嘌呤5',8-环-2-脱氧核糖核苷的非对映异构体。 点击此处查看大图 。

图6。 C5的自由基的生成，通过光解5或10 HO•自由基反应，嘌呤5',8-环-2'脱氧核糖形成的机制。 点击此处查看大图 。

图7。协议f或识别一些激进的基于DNA病变线粒体DNA：线粒体DNA，nDNA的核DNA。

图8。光化学反应器。

图9所示。血浆胆甾醇酯的代表性的拉曼光谱在插图与胆甾醇亚油酸酯，胆甾醇单-反亚油酸异构体的特定区域的比较。

图10。的FAME写照GC分析得到的从血浆中胆甾醇酯。

<强大的图11。代表HPLC含有2'-脱氧腺苷运行，和2'deoxyguanosine连同他们的氧化和嘌呤5',8-环-2'-脱氧核糖核苷。 点击此处查看大图 。

讨论

自然发生的几何反式异构体的顺式不饱和脂肪酸的转化是在生物环境中的自由基应力与生产连接的变换。细胞膜的脂质，其中含有不饱和脂肪酸，是一个有关生物目标为激进的压力，并在细胞培养，动物和人类的评估分析协议，在每一种情况下，我们首先研究了内源性的顺反磷脂异构化^。8-10表明，这种转变的发生可通过各种各样的含S-的化合物，包括硫醇，硫醚，二硫化物，其中不同的自由基应力条件下能够生成生成硫中心自由基， 即异构化剂（ 图3）。在这篇文章中所显示的示例集中在胆固醇酯之类的，它代表的是知名的一部分，参与脂蛋白代谢血脂，严格。之间的酯键的脂肪酸和町lesterol生物合成的脂肪酸由转印从磷脂酰胆碱的甘油部分的位置2的胆固醇，通过酶卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）催化步骤。因此，血浆胆甾醇酯是严格连接与膜脂周转，含有相对较高比例的多不饱和脂肪酸（PUFA），通常存在于磷脂酰胆碱， 即亚油酸和花生四烯酸。脂蛋白的形成涉及心血管疾病和代谢性疾病。天然胆甾醇酯与自由基的反应性，可以发生在双键的亚油酸和花生四烯酸酯的残基，它可以在相应的反式几何异构体转化（参见图1的结构）。生物样品中的反式胆甾醇酯的含量是表征有趣的生物标志物的发展。间接方法包括改造cholestery升酯从血浆中分离出相应的脂肪酸甲基酯（FAME）和分离的气相色谱协议。在这种情况下，被执行时，顺式和反式脂肪酸甲基酯的标准参考文献的校准，以便使样品中的反式含量的定量分析。上的胆固醇酯库进行分析研究的基础上，我们提出，也适用于基于拉曼光谱的方法，可以直接进行从血浆中分离的胆固醇酯馏分，没有进一步的衍生的相应的FAME（见图2和9）。这是值得注意的，到现在为止没有成功的方法描述为独立的顺式和反式异构体通过HPLC含有脂质的脂肪酸，而不是所描述的胆甾醇酯的氢过氧化物。到目前为止，间接气相色谱测定方法至今仍然是最为有效的方法。通过该方法的第一定量评估通报BULLETIN来自孤立从健康受试者血浆中的胆甾醇酯的单 - 反式含量提供。使用火焰离子化检测器（FID）的可探测的极限是令人满意的分之一（ppb）和已被检测到的化合物的毫微摩尔数量^。5。对于不同的检测系统，这个限制可以在更低。电离辐射对胆甾醇酯的效果进一步的研究中，无论是一个线性响应是否得到相对于所施加的剂量。

作为第二个例子，我们选择了可以产生自由基损伤的DNA的修饰核苷。羟基自由基（HO•）是已知的最有害的活性氧（ROS）的能力，导致化学修饰DNA。单个或多个病变可能发生在真核细胞中DNA，位于细胞核和线粒体。识别和测量DNA的氧化损害的主要类需要appropr第十一条分子库，以建立解析协议。我们的兴趣集中在最小的串联病变，是嘌呤5'-1,8 - 环-2'-脱氧核糖核苷，具有一个额外的由自由基攻击创建的基极和糖部分之间的共价键。本发明的化合物是5'-1,8 -环-2' -脱氧腺苷和5'-1,8 -环-2' -脱氧鸟苷的5'R和5'S非对映体形式（ 图5）中存在。它们可能成为自由基应激标记是物质的基础研究。事实上，当DNA暴露在HO•自由基氢抽象的糖C5'的位置是导致这些串联病变的形成可能发生的事件之一。嘌呤5'-1,8 - cyclonucleosides可作为非对映异构体的总和，通过酶促消化γ照射的DNA样品，不同的从1至12的病变/ 10 ⁶核苷/戈瑞HPLC-MS/MS测定氧的形式没有去氧气的生理水平我Ň组织，非对映体比率5'R / 5'S〜4和5〜3'-1,8 - cdAdo和5'-1,8 - cdGuo，分别为（ 图^11）11，值得注意的是，辐射剂量之间的关系和5',8-cdAdo和5',8-cdAdo病变细胞的DNA中检测到的是被理解。不能被视为基于2kGy照射单实验报告在实验定论。这种和分析定量的四个病变^11的进一步的实验，用于定义这种关系是必要的。这些病灶的检测和更流行的氧化变换（如8 -氧代-2'-脱氧鸟苷，8-oxodGuo的）物质的激烈调查，证明两个病灶的氧化代谢过程中的重要性^。6,13使用HPLC -MS/MS（三重四极杆）的检出限30fmol个病灶。最后的改进声称的工具机生产线达到渺摩尔水平的检测限为核证减排量。在最近的文献中，分析程序必须包括适当的清理，以满足MS / MS / MS（离子阱）或MS / MS（三重四极杆）的检出限的样品和浓缩在我们的例子。

仿生的化合物1-4的合成方法，从8-bromopurine的衍生物下或光解开始开发^。7,12这些程序涉及的自由基级联反应，模仿的DNA损伤的机制形成5星'-1,8 - cdAdo和5' ,8-cdGuo病变。从生物学的角度，发现这些病变积聚老化的组织特异性的方式（肝>肾>脑），提供的证据表明，DNA修复机制是不足以维持这些病变的遗传物质从¹³事实上，核苷酸切除修复（NER）是唯一的途径目前已确定的这些病变的修复^。

这两个类在图1和图5中所示的化合物的上课不是市售的时刻，但是，在文献中描述的合成策略它不会是用于商业用途，难以制备这些化合物。

化学生物学研究提供了多学科的方法不仅具有识别的新的机制，在生物环境发生了巨大的价值，而且还给出了一个根本性的贡献的生物标志物的发现和诊断，最终带来新颖的保健和预防策略^。14化学的贡献是一个成功的分子医学的发展需要，创建集成的平台和面板的代谢分析，预计允许，治疗和营养干预的最佳合理化设计，减少不确定性和失败时，他们可以预测的。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATERIALS
Cholesteryl linoleate ≥98%	Sigma-Aldrich	C0289-100 mg
Cholesteryl arachidonate≥95%	Sigma-Aldrich	C8753-25mg
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M6250-100 ml
2-propanol	Sigma-Aldrich	34965-1L
Methanol 215 SpS	Romil	H409-2,5 L
Ethanol	Sigma-Aldrich	02860-2.5L
Chloroform SpS	Romil	H135 2,5 L
n-Hexane 95% SpS	Romil	H389 2,5 L
Acetonitrile 230 SpS	Romil	H047 2,5 L
Dichloromethane SpS	Romil	H2022,5 L
Carbon tetrachloride	Sigma-Aldrich	107344-1L
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	309966-1L
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
NaOH solid	Sigma-Aldrich	221465-25G
NH4OH sol. 28%-30%	Sigma-Aldrich	221228-1L-A
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride	Sigma-Aldrich	221759-100G
Ammonium Molybdate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	A7302-100G
Sulfuric Acid 95%-98%	Sigma-Aldrich	320501-1L
Silver Nitrate	Sigma-Aldrich	209139-25G
Sodium sulfate anhydrous	Sigma-Aldrich	238597-500G
Nuclease P-I from penicillium citrinum	Sigma-Aldrich	N8630-1VL
Phosphodiesterase II type I-sa	Sigma-Aldrich	P9041-10UN
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc	Sigma-Aldrich	E114-25MG
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov	Sigma-Aldrich	P6774-1KU
Phosphodiesterase I type VI	Sigma-Aldrich	P3134-100MG
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin	Sigma-Aldrich	D4138-20KU
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce	Sigma-Aldrich	T6066-100G
EDTA	Sigma-Aldrich	E1644-100G
Succinic acid bioxtra	Sigma-Aldrich	S3674-250G
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670-100G
Formic acid, 98 %	Sigma-Aldrich	06440-100ML
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane	Millipore	UFC500324
8-Bromo-2'-deoxyguanosine	Berry Associates	PR3290-1 g
8-Bromo-2'-deoxyadenosine	Berry Associates	PR3300-1 g
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3899-CA-0.1
2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3895-0.1
Nitrous oxide (N2O)	Air Liquide
Deoxyribonucleic acid from calf thymus	Sigma Aldrich	D4522-5MG
EQUIPMENT
60Co-Gammacell	AECL- Canada	220
Immersion well reaction medium pressure 125 watts	Photochemical reactors ltd	Model 3010
Evaporating flask 250 ml	Heidolph	P/N NS 29/32 514-72000-00
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm	Phenomenex	00A-4252-E0
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm	Grace	88081	Semipreparative
SecurityGuard Kit	Phenomenex	KJ0-4282	Analytical holder kit and accessories
Holder for 10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7220	Semipreparative holder
10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7221
High-performance liquid chromatography (HPLC)	Agilent	1100
LC/MS/MS	Applied Biosystems	4000QTRAP System
Tandem mass ESI spectrometer	(Bruker Daltonics)	Esquire 3000 plus
Vial 2-4 ml	SUPELCO	Cod 27516
Vial 4 ml	SUPELCO	Cod 27517