纵向，非侵入性的移植到眼睛的前房<em在体内</em&gt;单细胞分辨率的实时成像

摘要

眼内移植和共聚焦显微镜相结合的一种新的方法移植组织内，使纵向的，非侵入性的单细胞分辨率的实时成像。我们演示了如何胰岛细胞移植到老鼠的眼睛前房。

摘要

活体成像已成为生物学研究的一个不可缺少的工具。的过程中，许多成像技术已经发展到在非侵入性动物研究的不同生物过程。然而，一个重要的技术在现有的活体成像方式的限制是无法以非侵入性的结合，纵向成像与单细胞的分辨能力。我们在这里展示，如何移植进入前房的眼睛，会在显着的限制，提供一个多功能的实验平台，使非侵入性的， 体内细胞高分辨率成像与纵向。我们展示了鼠标和移植过程中使用的模型与临床相关性，即胰岛移植提供有代表性的结果。除了能够直接可视化的各种组织移植到眼的前房，这种方法提供了一个平台，卵石Ň药物进行长期的跟进和监测靶组织中。由于它的多功能性，组织/细胞移植到眼睛的前房不仅有利于移植疗法，它延伸到其它在体内应用研究的生理和病理生理过程，如信号转导和癌症或自身免疫性疾病的发展。

引言

在活体显微镜的进展显示，预计不会在体外研究中的生理现象。这突出表明在体外培养的方法，通过常规的活的动物的研究结果，在翻译的挑战。在过去的十年中，大大改善生活的动物的组织中的可视化技术进步的成像方式^{2，3，4，5，6。}这促使需要在体内成像方法与可行的在实验动物模型中的应用，使纵向的非侵入性的靶组织的可视化。

启用非侵入性的成像技术，如磁共振成像和正电子发射断层扫描或生物发光成像的器官/组织深身体内的^7-8，9。但是，这些技术无法实现单细胞分辨率高的背景信号和低空间分辨率，但使用of高对比度的材料或组织特异性的发光^4。这是解决与双光子荧光共焦显微镜¹⁰的到来。双光子显微镜活体成像研究，以前所未有的细节^11，12，可视化和量化细胞的活动。这导致了在健康和疾病的^{13，14，15，16中}的关键的生物过程的表征。开拓性的活体成像研究主要是“模仿” 在体内切除的组织（ 如淋巴结）的条件，但其他研究已经使用侵入性的方法，图像暴露目标组织在原位 ^{17日，18日，19日，20日，21。}其他研究也使用“窗口室模式”，以规避限制，与侵入性方法和有限的成像分辨率在体内 ^{22日，23日，24日，25。}在窗口中的腔模型中，一个腔室与一个透明的窗口是在不同的外科手术植入到皮肤租金位置（背侧或耳部皮肤，乳腺脂肪垫，肝等）上的动物（ 如小鼠，大鼠，兔）。虽然这种做法显然使高分辨率成像在体内 ，它需要一个微创手术植入室，可能无法以适应纵向成像研究在数周或数个月^22。

这是最近展示了一种微创手术，即移植到前房的眼睛，结合高分辨率的共聚焦显微镜（ACE）提供了一个“自然的身体”窗口“作为一个强大和灵活的体内成像平台^{，26日，27。}移植到ACE在过去的几十年中被用于研究生物方面的各种组织^{28日，29日，30}和其最近的高分辨率成像结合，使胰岛生理研究单细胞分辨率的非侵入和纵向^{的26，27。这种方法被用于研究自身免疫反应，在开发过程中的1型糖尿病的动物模型（未发表资料）。它也被用来研究胰腺发育，以及，在肾功能的研究，通过移植到的ACE胰芽或个别肾小球，分别为（未发表的数据）。最近的一份报告使用这种方法进一步证明其研究中的应用胰岛移植31后的免疫反应。更重要的是，本研究表明，移植到的眼球的前房中，提供了一种自然的身体窗口来执行：（1） 在体内的移植组织的纵向的，非侵入性的成像，（2） 在体内 cytolabeling评估细胞表型和生存能力原位 ;（3）实时跟踪，在靶组织中的免疫细胞浸润;（4）通过局部应用或眼内注射的地方干预。}

在这里，我们ðemonstrate如何进入前房的眼睛胰岛进行移植。

研究方案

下的立体镜执行下面的过程，2步，第一步涉及胰岛加载到套管和第二步骤是实际的移植到ACE。对动物进行的所有程序批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC），迈阿密大学的。

1。载入套管用于移植的胰岛

1. 中心的胰岛细胞在培养皿中通过旋转的菜在缩小圈子。
2. 断开的“蓄水池”，并将其放置在清洁的表面和连接管的套管套管。水库可以做出来的300微升一次性塑料吸管尖不带过滤器（ 图1a）。
3. 冲洗气泡时吸进水库的水库，以确保源源不断的小岛。法拉盛水库是通过推动免提电动注射器驱动程序使用的脚踏（ 图1b，c）。这也将在注射器中的空间，以允许吸入的胰岛入储液器（预加载了，如生理盐水，PBS或培养基的无菌溶液）。
4. 轻轻吸出所需数量的胰岛入水库。胰岛往往会旋转，当他们进入水库，将继续向底部。愿望是做的向后驱动电动注射器使用脚踏板驱动程序。
5. 插管重新连接到储存器经由所述连接管。
6. 将导管尖端在培养皿中，并刷新了小岛的水库管，然后在套管。确保小岛留在一起，因为你回填管/套管轻轻“弹”（攻丝）管（ 图1d）。之前或之后的所有气泡停止提前胰岛被冲出插管。如果不能确定，停止小岛的套管剩余的空气进入回气泡领先的胰岛细胞可以帮助防止反流（逆流）的胰岛细胞的ACE。会在一夜之间消失。
7. 在这个阶段，你准备好注入到的ACE（请参阅下面的步骤）的小岛。

2。胰岛移植到眼睛的前房

1. 麻醉在一个温暖的鼠标垫在体视镜上。
2. 将口鼻部的鼠标连接到氧气/异氟醚麻醉机麻醉“面具”。该掩模是做出来的1毫升的一次性塑料移液管尖（不带过滤器），通过麻醉油管连接的窄端（ 图2A，B）。
3. 轻轻缩回眼睑的眼睛，用另一只手的食指和拇指，“啪”的眼睛了更好的接触和方便地访问（ 图2c）被移植。不妨碍呼吸的鼠标，过大的压力，这将需要一些练习来完善颈部或阻止血液流向头部。
4. 使用一次性胰岛素注射器（29 - 31G），手术刀，小心地渗透只是冰山在角膜上，使一个单一的横向切口。使切口在角膜和角膜缘的顶点之间的中点位置处，以尽量减少在注射过程中，满分的ACE（ 图2d）回流的胰岛。
5. 小心通过切口插入套管（预装小岛）。
6. 慢慢地弹出胰岛的套管和虹膜的顶部将它们存放。为了避免由于过大的压力积聚在ACE的胰岛回流，弹出的小岛在短暂的推力体积小（S）可能在象限相反的切口。这可以进一步确保在加载套管（请参阅第1.6步），通过压缩胰岛管。
7. 慢慢地缩回套管的ACE。这是关键的一步，特别是，如果将大量的胰岛细胞注射压力由于胰岛回流确保建立内部的ACE可能是不可避免的。为了消除，/尽量减少胰岛回流，轻轻地旋转套管内的ACE释放多余的压力通过切口周围的套管。检查是否有回流的迹象，如果您尝试收回的套管，如果需要的话，等到压力消退之前完全缩回套管的ACE。
8. 用无菌PBS或生理盐水冲洗移植眼。
9. 注射丁丙诺啡术后镇痛（0.05-0.1毫克/公斤），皮下的第一个48小时。
10. 红霉素眼药抗生素软膏后立即移植到移植的眼睛。
11. 将动物在加热的笼子，让从麻醉中恢复。

结果

有几个参数来定义一个“好”移植。一个良好的移植是会继续进行，而不会出现出血使切口在视频中可以看出，当一个。出血防止/最小化到ACE仅贯通的手术刀（针）的前端（ 图3a）。这也将有助于防止虹膜的接触和穿刺。它也将确保小切口愈合得很好，而不会造成角膜混浊随着时间的推移（ 图3C，D）。一个成功的移植的另一个重要的方面是可移植的胰岛的总的所需量，?...

讨论

小鼠胰岛分离使用胶原酶消化其次密度梯度纯化，如前所述^，33。胰岛移植前培养过夜。虽然这可能不是必需的，它建议允许从隔离过程中恢复的胰岛。这是因为这将确保幸存的/强大的胰岛细胞移植时，移植糖尿病的收件人进行。

移植全身麻醉下进行，与氧/异氟醚混合物（1.5-3％）吸入效果。可以用来替代吸入或注射麻醉剂（ 例如，氯胺酮）。如果注射麻醉?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	说明/意见
IsoTHESIA（异氟醚）	Buttler动物保健供应	11695-6775-2	99.9％的异氟醚/毫升
Ketaset（氯胺酮HCL）	Fort Dodge动物保健	0856-2013-01	替代注射麻醉
Beprenex（丁丙诺啡HCL）	Reckitt Benckiser公司健康护理（英国）有限公司	12496-075-7-1	0.3毫克/毫升
红霉素眼膏USP，0.5％	阿克伦	17478-070-35	预防移植眼
0.9％氯化钠（生理盐水）	赫士睿公司	0409-7983-03	静脉注射。无菌
PBS	Gibco公司	10010-023	1X。无菌
CMRL中等1066	Cellgro	98-304-CV	补充，CIT修改。为小岛的首选媒体