该<em&gt;在OVO</em&gt; CAM作为一个肉瘤Xenograftmodel的检测

摘要

该在OVO绒毛尿囊膜（CAM）接枝源性肉瘤的新鲜肿瘤组织中，其单细胞悬液，并永久和瞬态荧光标记的建立肉瘤细胞株。该模型用于研究移植（活力，Ki67的增殖指数，坏死，浸润）和主机（成纤维细胞浸润，血管长入）的行为。

摘要

肉瘤是一种非常罕见的疾病，在本质上是异质的，都阻碍了发展的新疗法。肉瘤患者的理想人选后分层的个性化医学，解释目前在开发这种疾病的一个重现性好，成本低的异种移植模型的兴趣。鸡胚绒毛尿囊膜，是一种天然的免疫缺陷宿主能够维持嫁接的组织和细胞，没有种属特异性的限制。此外，它很容易访问，操纵和使用光学和荧光立体显微镜成像。组织学进一步允许异型细胞相互作用的详细分析。

该协议详细描述了OVO绒毛尿囊膜移植肉瘤派生的新鲜肿瘤组织，其单细胞悬液，和永久和瞬态荧光标记的建立肉瘤细胞株（系Saos-2和SW1353）。小鸡存活大鼠上课是高达75％。该模型用于研究移植（活力，Ki67的增殖指数，坏死，浸润）和主机（成纤维细胞浸润，血管长入）的行为。对于单细胞悬液的本地化嫁接，ECM凝胶提供了显着的优势，在惰性容器材料。 Ki67增殖指数的距离的凸轮表面的细胞和CAM上，后者确定的治疗产品的另外的时间框架中的应用的持续时间有关。

引言

肉瘤是一种罕见的肿瘤治疗抵抗^1,2由于死亡率高的结缔组织。患者的生存率进展受阻低的年发病，其广泛的多样性，以及肉瘤细胞的事实，据报道， 在体外难以培养^3,4。

使用培养细胞的临床前治疗评价已经表明，新的，显然是在体外的活性分子并不总是反映在临床上的结果。此外，揭示了基因表达阵列的基因畸变并不总是与个别病人^5-7的肿瘤行为特征。为了试图解决这些问题，已经获得了个性化医疗的重要性，这也反映在增加搜索异种移植模型^8-12。

在体内试验中的一种反映复杂的相互作用的优点是与c的相关关系在固体肿瘤细胞与宿主组织环境，必要的癌细胞增殖和侵袭^13。目前，我们研究使用绒毛膜尿囊膜法（CAM法）作为一个可重复的异种移植物模型肉瘤^14,15。本试剂盒被广泛用于肿瘤血管生成的研究^16,17。然而，在文献中，我们已经发现这个实验的不同的协议，而其他的研究观察到的生长或血管生成的显着性差异，根据不同的协议^18,19。

在这篇文章中，我们探讨不同的CAM检测条件对细胞行为的肿瘤移植，肿瘤来源的单细胞悬液和既定的肉瘤细胞培养的效果。

研究方案

参见图1的概述

肿瘤材料

1。肿瘤样本的获取和准备

的伦理委员会的批准，如果在病人的材料的使用是必要的，从病人取得的知情同意书。

1. 嘉实代表材料（最小为1厘米^3）干预的时间，无论是活检或切除的肉瘤。活检定义适当的地点使用动态对比度MRI。
2. 立即将材料在无菌小瓶含1000 U青霉素和1毫克/毫升链霉素DME​​M培养基。
3. 运输样品瓶立即（30 - 90分钟）到实验室。

所有下面的程序进行，在层流。

4. 将瓶中内容物倾入无菌的陪替氏培养皿中。
5. 将肿瘤最大限度地1米的一小部分样品放入³用消毒的手术刀。删除所有钙化的部分，因为他们往往​​会削弱进一步的组织处理。
6. 随机取10个肿瘤移植应用CAM。

2。肿瘤来源的单细胞悬浮液的制备

持续时间：约3小时

1. 称取样品的其它组织。
2. 取约2 - 4克组织离解器管中，可能需要一个以上的管消化所有其它的肿瘤组织。
3. 2 - 4克组织的消化，加2.5毫升胶原酶溶液（500 U / ml的RPMI 1640）和2.5毫升DNA酶溶液（22 KU / ml的RPMI 1640）。
4. 根据离解h_tumor协议处理该组织。这涉及到在CO ₂培养箱_中在37℃下保温2个循环的，而管轻轻摇动30分钟。
5. 通过150微米的细胞过滤过滤剩余的悬浮液。
6. 裂解液以1000rpm离心5英里名词
7. 去除上清。
8. 将沉淀重悬于10ml的红细胞裂解缓冲液（ELB），允许与常规悬浮液温育10分钟。

注意：红细胞裂解液如下制造：加入0.037克EDTA，0.99克K ₂ HPO _4，8.29克_氯化铵到千毫升水产，使用10N的氢氧化钠将pH调节至7.3，过滤器在压力下通过0.22μm的过滤。贮存于4℃

9. 加入25毫升的培养基（补充有10％胎牛血清，100 U / ml青霉素和100μg/ ml的链霉素的DMEM培养基），使反应停止。
10. 离心悬浮液，以1,000 rpm 5分钟。颗粒的颜色应该是白色。
11. 去除上清。
12. 加入5毫升的介质颗粒。通过70微米的细胞过滤，过滤悬浮液。
13. 通过自动细胞计数器计数活细胞/ ml的数量。

3。 Ç的相关关系及细胞系

电SAOS2骨肉瘤细胞（ATCC编号：HTB-85）表达增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1载体，使用的细胞株Nucleofector试剂盒V根据制造商的协议。建立稳定的细胞系，转染的细胞中选择G418（1毫克/毫升），连续4周线与先前建立的一种协议^20。此外根据制造商的说明，通过荧光激活细胞分选（FACS）进行排序。

SW1353软骨肉瘤细胞株（ATCC编号：HTB-94）或新鲜制备肿瘤单细胞悬液的细胞标记，用红色荧光亲脂膜染色。

1. 在经典的方法，用胰蛋白酶（0.5％重量/体积）乙二胺四乙酸（EDTA，0.2％重量/体积）溶液中除去细胞从培养瓶中。
2. 离心细胞悬浮液，以1,000 rpm 5分钟。
3. 删除supernatant。
4. 加入1 ml无血清培养基和5μl的DiI荧光（Vybrant红）/ 10 ⁶个细胞。
5. 铝箔包装小瓶，并把它在10分钟，在37℃的CO ₂培养箱
6. 以1,000 rpm 5分钟，再次离心，去除上清。

绒毛尿囊膜试验

1。卵孵化

1. 保证95％的受精鸡蛋从当地的商业孵化的受精卵是必需的。
2. 受精卵在RT下，可以存储多达10天。

注：开始孵化前，仔细去除灰尘，羽毛和粪便是从蛋壳机械用纸巾，柔软的表面结构，而不是一个有一个粗略的干擦。用70％变性乙醇或其它任何清洁试剂擦拭鸡蛋的小鸡胚胎的存活率显着降低。

3. 把鸡蛋放进incubATOR的一侧上，标记的上表面。在这一天的鸡蛋都放在孵化器被指定胚胎发育的第0天。
4. 设定的培养温度37.8℃，湿度控制在47％。确保“自动旋转”选项关闭。

2。鸡蛋开幕

时间：±60分钟，25个鸡蛋。

在发展的第3天，鸡蛋打开层流气流下。打开鸡蛋损害到CAM进一步发展阶段性成果，膜往往坚持到shell。红外线灯在操作过程中用于保持蛋温暖。为了提高不育，我们建议使用手套。

1. 将鸡蛋的蛋杯，填划的一面朝上。
2. 通过去除两个毫升的蛋白水平降低的CAM通过18G的针的尖端处的蛋。如果针头钝射孔后几个蛋壳，更换针头。如果不是，用力过猛，也有需要充分发挥，造成损坏蛋黄或断裂的外壳。有时针阻塞的系带，其中的2个螺旋带，暂停的蛋黄蛋清。这个问题可以通过轻轻推入柱塞回落，直至该块被解决。如果被吸入到注射器蛋黄，更换的针和注射器。有时胚胎死亡后，此事件。如果除去蛋白量不足，则CAM将被损坏，当外壳被除去。
3. 在标记的上侧的外壳，以防止溢出壳粒子到CAM切割窗口的同时应用的半透性粘接薄膜。
4. 用小锥子在蛋的表面作一介绍孔。
5. 切为1cm ^2：在外壳的窗口，使用一对无菌尖头手术剪。
6. 胚胎的跳动的心脏和毗邻船只可以观察到日E面的蛋黄。删除未受精的蛋或死胚。一个被中断的血管方面的特征死胚。
7. 密封窗口的半透性粘接薄膜。这是没有必要覆盖穿刺部位，在插入针的过程中，除非壳破裂。

3。接种程序

时间：±1小时，每细胞系

在小鸡胚胎发育的第9天，卵层流气流下接种。

遍布的CAM的肿瘤细胞评价需要的细胞在接种过程中的有限表面的遏制。基底膜是一种细胞外基质（ECM）凝胶中经常使用的实验细胞培养条件从Engelbreth-Holm的群小鼠肉瘤。在冷却时，它是一种流体，但将进行热激活的聚合时，到第20 - 40℃，从而形成一个稳定的凝胶。中实验中，基底膜保持在一个盒子里含有融化的冰。

注：我们坚持不使用穿孔盖玻片。我们观察到接枝的癌细胞的粘附和生长到塑料圆盘，从而偏置膜本身上的细胞的生长潜力。

1. 重悬细胞沉淀在冷却的ECM凝胶的浓度为10 ⁶ cells/100微升ECM凝胶。保持这个解决方案上的冰融化。
2. 海关部分的半透膜，根据层流无菌手术的一对。如果粘接膜完全除去，这将导致胚胎死亡，由于污染的比例较大。
3. 触摸shell窗口的CAM正下方用无菌玻璃棒轻轻地，为了除去上皮细胞层。触摸CAM用无菌玻璃棒被证明是比使用手术刀的编号为11，这需要更多的轻便和经验的创伤小。可能会出现小出血。
4. 一肿瘤材料dding。
5. 对于肿瘤移植：轻轻放下一对无菌镊子的CAM组织到一块，不挤。
6. ECM凝胶过程：4倍的25微升的细胞-ECM凝胶悬浮液加入到CAM，在彼此的顶部，使ECM凝胶聚合在应用程序之间的。以这种方式，包含癌细胞粘附斑块被创建。
7. 再次用一个半透胶粘剂膜密封外壳窗口。

4。在CAM的成像和收获

时间：2小时25个鸡蛋。

在小鸡胚胎发育的第16天，凸轮收获。下工作的层流是没有必要的。

1. 一对手术剪，放大该窗口。确保不削减太低，否则将被损坏的CAM，导致受伤的血管出血。
2. 添加300 - 500微升的PBS ^D到CAM教派用吸管含有接种物的离子。如果没有荧光探针的使用，甲醛缓冲液可以用作使膜更硬，促进膜的切断。
3. 通过立体声荧光显微镜，配备一个数字彩色摄像机，使用GFP或的DSR滤波器，没有过滤器，使照片的CAM蛋。对于肿瘤移植，所有照片都没有过滤器。强烈建议从上述LED灯照明，在拍摄过程中（ 图2）。
4. 记录肿瘤细胞标记细胞迁移。肿瘤的边界可能是不规则磨损。分散的细胞可能是肿瘤边界附近。在一些样品中，可以观察到肿瘤细胞的行（ 图3）。
5. 无菌剪刀的一对切膜对壳躺在上面的边界。
6. 将收获的CAM在无菌培养皿中充满与PBS ^D或缓冲甲醛。
7. 的上侧和下侧的凸轮，与不带过滤器的照片。
8. 将膜与缓冲甲醛中至少72小时，在有标签的容器。
9. 嵌入凸轮的石蜡和准备作病理检查。小心切肿瘤移植在结节的中心，确保切割表面是平行于磁带盒的底部。如果没有，CAM和肿瘤移植物之间的相互作用将不可见。相同的策略适用于对ECM凝胶斑块：相对的面的切割刀片应垂直于斑块。

5。组织学评价

苏木精 - 伊红染色和Ki-67免疫组化进行了进一步澄清，如果需要的话。免疫组化法对福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片厚度为3.5μm，使用自动幻灯片染色机根据制造商的指示。鼠标主单克隆抗体（克隆MIB-1，稀释1/100），Ki-67的使用。热诱导抗原活化检索使用细胞，书桌1，可视化，实现与通用的DAB检测试剂盒，根据制造商的说明。组织切片进行了Dehydratation使用自动盖片。

的的SAOS2和SW1353细胞系，Ki67的阳性和Ki67阴性细胞^{nuclei/100μm2}的数量进行计数在三个区域：一个比较接近的CAM的边界，一个关闭的表面和一个在中心的ECM凝胶牌匾。这个过程重复每个Ki-67的染色后的载玻片的6倍。指数增殖细胞计数的总数除以Ki67的阳性细胞的数量为每个幻灯片确定。

坏死的定义是在细胞核内染色质的微细分散的损失，伴随着法迪纳克的不同单元格边距。异种移植，坏死得分完整，部分（通常在表面），或缺席。由观察到CAM的肿瘤细胞的浸润是指肿瘤细胞的CAM中胚层内，被评价为存在或不存在。

三个项目都取得了主机的行为。成纤维细胞浸润被定义为拉长的细胞，使CAM和入侵移植瘤/斑块，得分为存在或不存在。向内生长增殖的小鸡容器，其特征在于成核的小鸡红细胞的存在下，可观察到血管向内生长。

结果

在CAM的评价

肿瘤移植变得附着到CAM（ 图2A）。单细胞悬液经常从病人的材料显示干燥，微微凸起的牌匾（ 图2D）。切除后的CAM，标志着起皱发生膜（ 图2E和2F）。

对于商业细胞株的牌匾变得更加不透明，表明细胞的增殖。 ECM凝胶在不同的细胞系有明显的增长模式上的CAM。 SAOS2形成一个蔓延斑块，表面从接?...

讨论

接种和收获的时间

时序进行SAOS2天接种ECM凝胶（36的CAM）和胚胎发育天5和10之间变化。

孵化前9天，CAM是不能持续大到足以支持我们采用ECM凝胶。收获时，肿瘤细胞有时不得不从更深的CAM检索，并在蛋白或CAM一些ECM凝胶样品躺在松动。在第5和第6天，这是很难避免把小鸡畸形或死亡，导致肿瘤细胞鸡胚。从第9天，在CAM被完全覆盖的大部分鸡蛋的窗口下面的表?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Line Nucleofector Kit V	Amaxa	VCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)	Sigma Aldrich	C6885
DMEM	Invitrogen	41965-039
DMSO	Sigma	D8418
Dnase solution	Sigma Aldrich	DN25
G418	Invitrogen	11811031
Matrigel	Sigma-Aldrich	E1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67	Dako Denmark	MIB-1
Paraformaldehyde	Fluka	D76240
PBS	Invitrogen	20012019
PBSD	Invitrogen	14040083
peGFP-C1 vector	Clontech	632470
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15140163
RPMI	Invitrogen	22409-015
Trypsin-EDTA solution	Invitrogen	25300054
Vybrant cell-labeling DiI	Lifetechnologies	22885
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
digital color camera	Leica	DFC 340 FX
Digital Egg Incubator	Auto Elex Co	R-COM 50
FACS	BD Biosciences	FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube	Miltenyi Biotech	130-093-237
Gentlemacs Dissociator	Miltenyi Biotech	130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol	Miltenyi Biotech
[header]
semipermeable adhesive film (Suprasorb F)	Lohmann&Rauscher	20468
stereo fluorescence microscope	Leica	M205 FA
Tissue-Tek Film automated Coverslipper	Sakura	6400
ultraView Universal DAB Detection Kit	Ventana Medical Systems Inc	760-500
Ventana Automated Slide Stainer	Ventana Medical Systems	Benchmark XT