同时捕获实时图像在两个发射通道采用了双摄像头发射分光系统：应用到细胞粘附

摘要

双摄像头发射分光系统，双色荧光显微镜生成具有出色的光学分辨率和时间分辨率，一定的活细胞检测的要求，包括平行板流动腔粘连检测的实时图像序列。当软件被用来从合并收购的同时发射通道的图像，伪彩色图像序列产生。

摘要

多色免疫荧光显微镜来检测特定的分子在细胞膜上可以加上平行平板流动腔实验来调查管动态流动条件下的细胞粘附机制。例如，标有多种荧光团的癌细胞可灌注了一个潜在的反应底物来建模癌转移的机制。然而，多通道单相机系统和彩色摄像机表现出的缺点在图像采集的实时活细胞分析。为了克服这些局限性，我们采用了双摄像头发射分光系统同时捕获荧光标记细胞的实时图像序列中的流室。双摄像头发射分光系统过滤器中定义的波长范围分为两个黑白CCD摄像机，从而同时捕获两个空间相同，但荧光的特定图像。随后，psuedocolored 1通道的图像被组合成一个单一的实时合并序列，可以揭示多个目标分子对细胞运动迅速在一个地区的利益。

引言

方法分子在细胞表面上，如免疫染色分析，采用被化学偶联至荧光基团，从而允许检测目标分子的探针。活细胞成像和流体动力流动为基础的细胞黏附测定法通常记录的黑白CCD相机设计在细胞和/或分子水平^1，2捕获的生理过程。这些摄像机是高度敏感的，提供快速的帧速率（大于每秒30帧），和（由于快速的帧速率和较短的曝光时间），提供出色的时间分辨率。然而，黑白相机只能捕捉到一个单一的发射通道（检测单个荧光基团）来采集图像。单个相机发射分光系统可并入到捕获多个发射信道，但往往减少视场并需要相同的曝光时间进行摄像的所有通道。要抓紧细胞标记MULTIP的全彩色光谱勒荧光团，一个彩色照相机可以作为一种替代方法。然而，彩色相机通常不能够提供期望在某些应用中的活细胞成像的时间分辨率。另一个成像装置所需的应用中，有利的是，图象的活细胞在多个波长，同时保持高的时间分辨率。一个主要的实验应用是在平行平板流动腔粘附试验，其中细胞被灌注在生理学相关条件下在一个潜在的反应基片^1，3。在流动细胞表达特定细胞表面分子可能粘附和轧辊的基体如表达粘附分子或表面吸附的细胞外基质蛋白^4，5的细胞单层上。轧制细胞可以在几分之一秒进行旋转和平移运动。上的滚动和粘附的细胞，如簇的细胞表面分子的分子功能，还具有电位人经过积极的重组在细胞表面上。因此，成像系统必须提供一个特殊的时间分辨率（每秒或更高30帧和“近零”的曝光时间），以生成示出的细胞轧制^6,7的一步一步的进展的图像序列。双摄像头发射分光系统能满足这些要求的成像单元带有多种荧光团。

双摄像发射分光系统拆分和滤波器荧光通道分成两个相似的摄像机同时捕获两个空间上相同，但荧光团特定的图象，同时保留的全视场。该技术使实时在每个通道中捕获的图像进行直接比较，并允许用户快速照相机模型之间具有不同的成像能力切换。此功能可用于制作在一个摄像头，更好地让系统捕捉调整图像捕捉设置有用荧光基团具有不同强度，寿命和消光系数^8。再加上成像软件，双摄像头发射分光系统允许在多个波长活细胞成像分析的实时记录，并可以提高在体外实验使用的荧光来研究细胞行为。

研究方案

1。软件安装

1. 购买StreamPix 5多摄像头软件SimulPix模块或能够收集并结合了黑白CCD相机拍摄的图像的其它图像软件。
2. 对于StreamPix 5最低要求包括：搭载Core 2 Duo处理器，2.4 GHz或更好地与2 GB RAM或更高的PC。受支持的IEEE数字或模拟相机和兼容图像采集卡。窗户XP/7/Vista 32位或64位。监视器支持分辨率1024×768或更高。 （建议OCU表达16倍或更高）的图形适配器具有良好的2D性能和7,200 RPM的硬盘驱动器，用于记录与RAID-O配置。

2。安装双摄像头系统能够双色同步实时成像

1. 通过滑动DC2 C型安装适配器插入MICR的视频端口连接DC2的配光发射分离器或类似的双摄像头发射分光装置，在显微镜OSCOPE，使得设备上的二向色性的外壳是可访问。
2. 插入两个黑白CCD摄像机转化为雌C接口1和女C型2。相同的摄像机是优选的。类似的相机也可使用，但兼容性是依赖于硬件的内部，最重要的是CCD图像传感器。
3. 使用图像处理软件来显示来自摄像机的图像。下面的步骤（2.3.1 - 2.3.4）适用于StreamPix 5与SimulPix模块，并且必须适用于其他的多摄像头成像软件。
   1. 打开StreamPix 5和任务色带选择“工作空间”。
   2. 打开“工作区管理器”位于最右边的屏幕并选择“新工作区”。
   3. 命名一个摄像头后，按照软件提示选择从预填充的列表中选择一个抓取。选择抓取匹配的相机型号和重复的第二个摄像头的工作区。对于合并后的工作空间，重复一次以上，但“所有的相机都在使用”错误米essage将出现。此消息是正常的。
   4. 一旦合并后的工作区被加载时，分配摄像机从工作区1和2的工作区，以在对接面板位于上观看屏幕的右侧合并的工作区。
4. 在双摄像头发射分光系统对准摄像头。
   1. 在明视场或通过使用PlanApo 40X物镜（或更大）的制造商所提供的校准网格相衬对准摄像机。
   2. 发送光显微镜目镜，将被提供由制造商在显微镜舞台上的金属涂层校准网格，方形网格上的显微镜载物台。
   3. 使电网成为关注的焦点。
   4. 取代，但不删除，分色住房对准摄像头1（旁路相机）。显示网格不分级，不自动缩放。在使用C型底座端口1的对焦调节旋钮聚焦影像。
   5. 推分色住房进入双channe升获得充分，从而图像被分割为二向色到两个相机设备。
   6. 松开3 5/64“设定螺钉和转动在阴C型2第二相机直到网格的取向是相同的两个图像中，利用聚焦调整拨盘上的C型安装口2，从相机带来的图像2成为关注的焦点。
   7. 使用组合图像中的成像软件的合并工作区完成对齐。这允许人们看到的校准网格的两个图像的实时伪覆盖。只使用R / L旋钮右侧DC2的调整合成图像的位置。调整此旋钮，直至图像的左/右垂直边界的精确对准。
   8. 使用U / D转换旋钮调整第二个图像的上/下排列，直到水平网格条正确对齐。
   9. 如果在向上/向下对准轻微旋转摄像头松开三个5/64“英寸SCRE发生时，正确的这个问题WS相机2和旋转，直到显示的图像正确对齐。

3。对平行平板流动腔附着力测定制剂癌细胞

1. 培养的BT-20乳腺癌细胞在最低必需培养基（MEM），补充以完成介质具有在37℃，10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素-链霉素和CO ₂如前所述² 5.0％。
2. 嘉实癌细胞用稀胰蛋白酶处理，并计算细胞血球。
3. 洗涤和悬细胞于10 ⁷个细胞/ 0.1％白蛋白的牛血清（BSA）的DPBS中的钙和镁（DPBS +）毫升。
4. 稀释的第一抗体，纯化的小鼠抗人CD24和纯化的大鼠HECA-452（抗-sialofucosylated抗原），在0.1％BSA的DPBS +预先确定的最佳浓度。孵育细胞30分钟^，9，10。
5. 离心细胞在1,200 rpm下，得到的细胞沉淀。 ASPI评价第一抗体，并用0.1％BSA的消毒副产物+洗涤细胞两次。
6. 稀释的二抗，山羊抗小鼠IgG AlexaFluor 568（发射最大值，603纳米）和山羊抗大鼠IgM AlexaFluor 488（发射最大值，519纳米），以预先确定的最佳浓度在0.1％BSA的DPBS +。孵育细胞30分钟。
7. 以10 ⁶细胞/ 0.1％BSA的DPBS +毫升洗涤细胞两次并悬浮在0.1％BSA的DPBS +。

4。对平行平板流动腔附着力测定制剂反应底物

1. 连接两个独立的管道长度，以适合在35 mm组织培养皿内的平行平板流动腔室的入口和出口端口。一个管将连接到标记的细胞悬浮于0.1％BSA的DPBS +和其它的注射器泵，这将在指定的流量抽出流体的贮存器。
2. 连接真空管线到流动室^1。
3. 定位流室在35mm组织培养二SH含中国仓鼠卵巢细胞单层表达E-选择素（CHO-E）。 CHO-E细胞在MEM完全培养基中，在37℃和5.0％CO ₂的^2。
4. 调整流动室和/或流室垫圈，以确保良好的真空密封件^1。
5. 从水库抽取液体，监测流动室组件进行适当的密封与 ​​空气形成气泡¹没有视觉证据。
6. 将流动室组件上的显微镜（Leica DMI ^6000B）1。

5。双色图像采集

1. 电力徕卡EL-6000紧凑型光源，或类似的装置，以产生高强度光夫妇到一个光导。使用倒置显微镜通过组合滤块， 即 G / R（绿色/红色）过滤器的立方体通过这个光，激发所需的颜色/亮度的荧光。
2. 确保分色住房是在正确的操作姿势（郁闷）和是不是在旁路模式。
3. 操作显微镜的荧光模式，并选择适当的荧光滤块（绿色/红色）。
4. 确定曝光时间和增益摄像头1（红色; 620±60 nm）和摄像机2（绿; 535±40纳米）。
   1. 踩下分色同时在红色和绿色发射渠道获取的图像。使用带有标记的细胞只有红色荧光的流动室试验中，通过调整摄像机1的曝光时间在成像软件的“实时设置”获得图像中的红色通道。
   2. 相机2的曝光时间匹配到照相机1的曝光时间。如果图像中的绿色通道观察，渗出通过伪影的存在，需要在两个相机的曝光时间可以缩短。
   3. 保持曝光时间相当于在摄像机1和摄像机2，减少曝光时间，直到扩散到工件不再在绿色通道可见。调整摄像机1的增益，以提高图像visibilitY的红色通道，如果必要的。
   4. 重复步骤5.4.1 - 5.4.3与标记的细胞只有绿色荧光，但与照相机2限定的曝光时间，以图像单元中的绿色通道而不在由照相机1所收集的红色通道渗出通过工件。
   5. 返滴定抗体，如果放气通过伪影不能被消除^11，或者如果摄像机1和摄像机2的曝光时间是显着不同，使得合并后的图像可以是在时间上对齐。
5. 使用图像处理软件来查看从流室实验二黑白CCD摄像机同时拍摄的图像。
6. 合并使用Streampix 5的SimulPix模块或另一种软件包，这两个摄像头采集到的图像。
7. 使用SimulPix或替代软件数字校正调整，如有必要，在空间上对齐拼接的图像，。图像可以用SimulPix模块为水平，垂直纠正和旋转调整。

结果

平行板流动腔粘连实验检测证明，同时捕获实时图像序列的两个发射信道的双摄像头发射分光系统（ 图1）。双相机发射分光系统检测出BT-20细胞，进行了荧光标记的抗人CD24和HECA-452（检测sialofucosylated抗原）的单克隆抗体和合适的第二抗体（ 图2）。一些细胞滚动显示红色信号（CD24）还检测不到绿色信号（HECA-452），其他显示绿色信号和检测不到的红色信号，并且还在其?...

讨论

双摄像头发射分光系统需要在应用中的细胞或分子的运动是快速捕捉高品质图像的空间，时间，以及光学分辨率。在产生代表性的结果，在双相机发射分光系统，包括软件的设置，相机设置的参数，进行优化以获得合并的图像序列，其中轧制和贴壁细胞，空间和时间上对齐。此优化步骤是关键的，因为未对准可导致图像不正确传达所研究的物理现象， 例如 ，观察到滚在两个绿色和红色通?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
BT-20 cells	ATCC	HTB-19
CHO-E cells	Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School)
MEM	Thermo Scientific	SH30024.01
FBS	Thermo Scientific	SH30396.03
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA	Thermo Scientific	SV30031.01
DPBS	Thermo Scientific	SH30028.02
DPBS+	Life Technologies	14080-055
BSA	Sigma	A9647
HECA-452 monoclonal antibody	BD Biosciences	555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody	BD Biosciences	555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488	Invitrogen	A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568	Invitrogen	A11004
[header]
Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera	Q Imaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera	Q Imaging	RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter	Photometrics	DC2
Inverted Fluorescence Microscope	Leica	DMI6000 B
Streampix 5 software	Norpix