蜱对动物饲养的传输和Xenodiagnosis在莱姆病研究

摘要

莱姆病是最常见报告的媒介传播疾病在北美。病原体， 莱姆病螺旋体是由蜱传播螺旋体细菌。传输感染的动物模型，并检测是通过使用刻度加料，其中我们在这里描述了优化。

摘要

莱姆病， 莱姆病螺旋体的病原体的传播，就会发生由硬蜱种的附着和吸血虱对哺乳动物宿主。在自然界中，这种人畜共患病原菌可使用多种储存宿主，但白足鼠（Peromyscus leucopus）是主要水库在北美幼虫和若虫蜱。人类是最常见的感染B.偶然的主机由蜱的若虫阶段。B.咬螺旋体螺旋体适应它的主机在整个地方性动物病周期，所以要探讨哺乳动物宿主这些螺旋体及其效果的功能的能力需要使用蜱喂养。此外，xenodiagnosis的技术（使用天然矢量检测和传染性病原体的恢复）已在神秘的感染研究是有用的。为了获得蜱若虫该港口B。螺旋体 ，蜱是通过毛细管喂活螺旋体的文化。两种动物模型，小鼠和非人灵长类动物，最常用于涉及蜱喂养莱姆病的研究。我们证明了这些蜱可在喂食，并从动物无论是感染或xenodiagnosis恢复的方法。

引言

2011年，莱姆病是在北美（第6最常见的在全国范围内通报的疾病http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ）B.螺旋体是一种多用途的微生物，无论是基因和抗原^（1审阅）。其遗传组成包括一个大型（> 900 KB）染色体和高达21质粒（12线，9圆），用分离株中质粒的内容不同。多是要了解该螺旋体，因为质粒的开放阅读框的90％以上是与任何已知的细菌序列^2,3，B。螺旋体呈现多种抗原作为宿主免疫的潜在目标。然而，一个未经治疗的感染往往持续存在。螺旋体的蜱环境和脊椎动物宿主环境的相互作用就必须适应由B.螺旋体在整个感染过程。几个质粒编码的基因是已知的差异表达以响应变化的温度，pH，细胞密度和虱子的生命周期^4-8的偶数级。

B的研究感染后的自然路线螺旋体适应整个流行性周期，宿主反应依赖于饲料蜱合适的动物模型的能力。这些研究都见了产生的滴答窝藏B的技术挑战螺旋体 ，并确保模型主机上的刻度高效传输和/或喂食。此外，受感染的蜱的遏制和恢复是至关重要的。其中所使用的模型是小鼠和非人类灵长类动物，其中每个作为莱姆病研究的重要工具。由于与白足鼠，这是一个自然储存宿主为B。螺旋体 ，实验室鼠标是支持持续感染的B.一个高度易感宿主螺旋体 ^9。折伞仰角调整疾病易感小鼠，如C3H品系的感染，螺旋体传播到多个组织，包括皮肤，膀胱，肌肉，关节和心脏。炎症反应的感染导致患病的心脏和关节组织。而螺旋体坚持这种主机和保持感染性，炎症性病变可能成为间歇性的，没有什么不同的进程中人类。在小鼠模型也因此提供了B.多的信息螺旋体引起的病变，包括关节炎和心脏炎和宿主免疫反应^10-12。来自病原体的角度来看，哺乳动物感染过程中差异表达的某些基因已被鉴定，因为有一些必要的用于从蜱矢量^13-21的传输。

虽然几种动物物种已被用于研究莱姆病^22，猕猴最密切模仿人类疾病²³的多器官字符。不像其他的动物模型中，疾病表现如游走性红斑，心脏炎，关节炎，以及外周和中枢神经系统的神经病变的广度在猕猴观察。在小鼠体内，储存宿主为B。螺旋体，病小鼠品系和²⁴年龄而异，而早期和晚期弥漫性表现是罕见的^9。此外，其它啮齿动物，兔类动物，犬科动物和所有不能从B.表现出神经系统疾病螺旋体感染^25。重要的是，猕猴表现出的迹象表明，在所有三个阶段莱姆疏螺旋体病，即早期的本地化，早期传播，晚期莱姆病^26-28的特点。游走性红斑（EM）被认为是发生在人类病例²⁹ 70-80％，并且也出现在恒河猴^28,30。感染后，螺旋体从接种部位传播到多个器官。螺旋体DNA已在骨骼亩被发现scles，心脏，膀胱，外周神经和神经丛，以及存在于中枢神经系统（大脑，脑干和小脑，脊髓和硬膜^）31。

勾选喂养小鼠已动用我们和其他研究小组对蜱菌落繁殖，在水库竞争力研究^32-36和B的研究螺旋体病机^37-40。这种技术也被用于xenodiagnosis和小鼠^41-44疫苗效力的测试。我们已经喂硬蜱蜱的非人灵长类动物模型开发^28，疫苗效力⁴⁵的研究，并为xenodiagnosis在持久性后抗生素治疗⁴⁶的评估。蜱的港口B.疏螺旋体可以被保持在一个天然的地方性动物病周期由在感染的小鼠喂养幼虫和使用若虫进行研究，作为螺旋体通过生命阶段发送。在这份报告中，我们指示如何生成感染了野生型和突变体B蜱螺旋体 ，利用毛细管喂养。这也可以通过显微注射⁴⁷和通过浸入⁴⁸来完成的。人工引入B的目的螺旋体进入蜱可学习的突变株，其传输率是未知的，生成一组蜱具有高感染率， ​​并保持清洁，否则未感染的壁虱的殖民地，以减少潜在的错误。此外，我们证明对小鼠和非人灵长类动物剔喂养，这样才能确保遏制和充满蜱的恢复。使用蜱喂养是对免疫反应B.今后的研究中必不可少的螺旋体感染，潜在的莱姆疫苗效力，并xenodiagnosis检测隐匿性感染。

研究方案

接种蜱和饲养动物时莱姆病研究的实验大纲如图1所示。

1。接种若虫硬蜱蜱与B螺旋体采用毛细管喂养

当执行操作与蜱，白色的实验室大衣与弹性套筒，手套，一次性保护帽磨损。

1. 我们的技术是所报道的布罗德沃特等人 ⁴⁹的修改版本。用移液管拉拔器加热和拉动巴斯德吸管打破薄准备毛细管。使用镊子和解剖范围，打破提示以最优的直径（约0.2​​mm）。标准化蜱口器大小的管子被用作上浆指导。面罩应该准备的移液管时佩戴。
2. B.成长疏螺旋体 ，以BSK-H培养基（Sigma）浓度之间的2-8×10 ⁷个/ ml的（对数中期）泰宁6％兔血清。
3. 使用已保存在23℃的4-6周后幼虫蜕皮蜱若虫。这里蜱上用双面胶带小的60×15mm陪替氏培养皿上的菜的外底表面上。将蜱腹面面朝上。
4. 浸毛细管尖端插入B。混合后螺旋体培养管。将毛细管过的蜱口器使用解剖范围的hypostome。使用成型粘土来固定管到位， 如图2A所示 。
5. 将培养皿里面一个大的透明塑料桶贴蜱围堵的添加水平。湿纸巾被添加到提供水分。将蜱在30分钟-2小时37°C的热孵化，直到排便是显而易见的。这表明，含有螺旋体传媒透剔已经过去了。
6. 休息蜱为2-4周，在23℃下，使适应环境打勾喂食前他们在动物身上。

2。感染小鼠B。由蜱螺旋体

1. 稀释氯胺酮股票在1:10无菌水。麻醉每只小鼠用腹腔内注射100毫克/千克氯胺酮用结核菌素注射器
2. 当鼠标被完全麻醉，背部用细（雷明顿润滑，如丝般）电动修边刮胡子鼠标从耳朵到中间。
3. 在一个白色的锅，没有其他物体附近，由湿的画笔转移蜱若虫（即海氏螺旋体 ）鼠标的无毛区。可替换地，未感染的蜱可以放置在老鼠的小鼠具有可疑感染xenodiagnosis。蜱放置使用干净的白色表面，有助于确保任何独立的蜱将很容易看到。
4. 将鼠标放置在专门的隔离罩（阿伦敦囚禁，宾夕法尼亚州Allentown）。该关进笼子由一个不锈钢格栅从笼子的底部升高的。 Ŧ他笼顶部是由我们的内部机加工车间改装提升，足以让下方的鼠标自由移动的水壶架。泛充满了约半英寸的水陷阱，脱落小鼠（ 图3A）任何蜱。为了尽量减少体温过低的危险，可重复使用加热垫，微波在使用前，被放置在笼子底下，直到小鼠从麻醉中苏醒完全。动物通常共济失调，因为它们从麻醉和抗擦的食物和水的托盘中恢复，所以这些必须去除。水位足够低，以防止小鼠的四肢从浸没。
5. 将笼子已经内衬纠结陷阱糊（CONTECH，维多利亚，不列颠哥伦比亚省，加拿大）和带托盘内，以确保节肢动物的压迫。小鼠单笼，并在麻醉期间连续观察。
6. 在2小时内，当小鼠从麻醉中完全清醒，食品托盘和水瓶被替换到笼子里。 2后4小时，住房富集由塑料小屋和nylabone被替换。
7. 经过3，4，5天，点击鼠标，笼和笼水喂蜱。笼中的水通过一个白色的金属锅过筛（ 即 “淘金”）。冲洗馈蜱在清水中并存储在塑料罐（ 图3B）。在天3和4，在笼子里用清水代替水。第5天，不仅要检查笼子，但鼠标彻底蜱。通常通过这一点，所有蜱喂养和小鼠可以返回到正规的笼舍。
8. 将所有的废物从鼠笼，包括液体，在生物危害容器和高压灭菌处理。保留日志放置在老鼠和那些恢复在任何时候都蜱的数量。

3。在非人灵长类动物的饲养为蜱感染B。螺旋体或xenodiagnosis

1. 准备剔防护装置：切在3英寸×1¾英寸直径的圆3英寸LeFlap（瓣）用干净的手术刀和测量指南。使用切出作为模板切割相同大小的圈中Biatane泡沫和Duoderm。该泡沫用于提升皮瓣在皮肤的表面上，防止蜱的可能破碎。的Duoderm添加缓冲的另一层和覆盖在遏制装置用于从蜱逃逸附加的安全的边缘。遏制装置的示意图示于图4。
2. 兽医工作人员将通过肌肉注射麻醉动物用5-8毫克/公斤Telazol。
3. 用夹子电动修边机（奥斯特）配备了大小40片动物的毛发。将要覆盖的外套所有区域都剪短背面，正面，上臂。使用剃须膏和双刀片一次性剃须刀，刮脸密切大约25厘米面积的垂直×20厘米水平。用干净湿纸巾和低热量干燥的皮肤吹干。
4. 将皮瓣在T他动物的背部，正下方的肩胛骨，对脊柱的两侧。使用一个标记，以跟踪在这个位置的圆圈。通过与SkinPrep擦拭准备周围一圈的皮肤区域。这消除了油的皮肤可能会影响胶水和密封装置的附着力。留下约的空间绕了一圈1厘米的圆周，涂上一层胶水皮肤（SkinBond）与〜4cm的宽度。
5. 拆下Biatane泡沫背胶，并加盖在适当的位置的皮肤。动物再次麻醉，由兽医人员以5毫克/公斤Telazol。轴封采用皮胶和Hypafix磁带的边缘。取下皮瓣背胶，并加盖在Biatane的顶部。放置Hypafix磁带绕LeFlap的边缘，然后用胶带向下折翼的网状瓣，然后将护套上的动物。磁带和昆布陷阱膏施加到地板在围绕非人灵长类动物笼舍为增加安全性的周边。
6. 为了尽量减少CHEMIC的影响在蜱喂养步骤3.4使用ALS，蜱添加24小时后防护装置到位。在这一点上，该装置的安全性也进行检查，如果需要加强。典型地，20不喂食若虫（4-8周后幼虫蜕皮）加入到用画笔装置内的皮肤。
7. 除去从襟翼的网状粘合剂衬垫和密封就位。最后，除去Duoderm膜露出胶，并将其放置在密封装置的顶部。加入跨开目圈了一块Hypafix磁带，并更换外衣。已完成的遏制装置示于图5A。
8. 后5天，麻醉动物如上述和外套被除去。先取出磁带通过网格（ 图5B）检查蜱喂养。仔细剥离Duoderm离瓣。
9. 回力网眼部分的边缘，以提供对蜱。美联储蜱常发现接近或下泡沫圈（ 图5C）和被除去并放置在干净的水用画笔。一旦移除所有可见美联储蜱收集到的设备（ 图5D）。

注意：通常情况下，该容器装置可以简单地被剥离远离皮肤。如果附着力强，并有可能损伤皮肤，Unisolve溶剂应用于为温和去除的区域。皮肤擦拭用异丙醇和蜱被存储在23℃下如果用于感染的蜱可以粉碎以确认含有B的数螺旋体，如果用于xenodiagnosis，蜱是前中肠内容分析保存1-3周。

结果

继完成毛细管喂养，蜱通常在休息23℃，2〜3周，他们被送到动物进行传输之前。利用毛细管喂养技术，我们发现美联储的90％以上蜱港口B.疏螺旋体。的阳性蜱的百分比是通过洗涤来确定蜱中过氧化物和乙醇，然后粉碎它们在无菌PBS用微量离心管形杵。肠内容物溢入PBS固定在玻片上，并用抗- 疏种抗体是FITC标记的。通过荧光显微镜观察代表蜱中肠涂片在图2B-C中所描绘

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讨论

为了获得该蜱B.海港螺旋体对下游的研究，蜱可以是：（1）在幼虫期饲喂感染小鼠;（2）浸在乙螺旋体文化无论是在幼虫或若虫期^48;（3）显微注射与B疏螺旋体 ^47，或（4）毛细管喂养B.螺旋体^49。虽然每种方法都有其目的，确保用于港口感染B的蜱一大截螺旋体 ，我们看好毛细管喂养。如果不要求接种与已知数量的螺旋体，所?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
BSK-H	Sigma	B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste	Ladd research	T-131
SkinPrep	Allegro Medical Supplies	177364
LeFlap, 3" x 3"	Monarch Labs
Hypafix tape	Allegro Medical Supplies	191523
SkinBond	Allegro Medical Supplies	554536
UniSolve	Allegro Medical Supplies	176640
Biatane Foam, adhesive 4"x4"	Coloplast	3420
DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border	Convatec	187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom	Lomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet puller	David Kopf Instruments	Model 700C
Dark field microscope	Leitz Wetzlar	Dialux
Dissecting microscope	Leica	Zoom 2000
Mouse caging	Allentown caging