模型和方法来评价药物输送系统在整个细胞屏障的运输

摘要

许多治疗应用需要药物载体及其货物横跨在体内细胞屏障的安全，高效的运输。本文介绍的方法，建立一个适应，以评估药物纳米载体（NCS）跨细胞屏障，如胃肠道（GI）上皮细胞的转运速率和机制。

摘要

亚微米载体（纳米载体; NCS）通过改善溶解性，稳定性，循环时间，靶向，和释放增强药物疗效。此外，穿越在体内细胞屏障是为口服给药治疗的NC进入流通和运输从血液进入组织，在需要干预至关重要。 （i）该细胞旁路线通过该互锁相邻细胞，或（ii）在跨细胞途径，其中材料是通过细胞内吞作用内在化，在整个细胞体运送，而分泌的结的瞬态干扰，：跨细胞屏障转运的NC被实现在相对的细胞表面（transyctosis）。跨细胞屏障递送可以通过偶联治疗剂或它们的载体与特异性结合到参与运输的细胞表面标志物的靶向剂来促进。这里，我们提供的方法来测量的程度和NC传输的机制跨越模型细胞屏障，WHI通道由胃肠道的单层（GI）的上皮细胞生长在位于一个transwell小室插入一个多孔膜。的渗透性屏障的形成是通过测量跨上皮电阻（TEER），控制物质的跨上皮转运和紧密连接的免疫染色证实。作为一个例子，〜200 nm的聚合物纳米晶的使用，它携带一种治疗货物和涂有靶向的细胞表面决定簇的抗体。所述抗体或治疗性的货物被标记^{的125 I}放射性同位素示踪标记和纳米晶加入到上室在细胞单层的时间期限不同。相关的细胞和/或输送到底层室的NC可以被检测到。免费¹²⁵我的测量允许的退化分数的减法。该旁路线是通过确定所造成的NC输送到上述的势垒参数的电位变化进行评估。跨细胞运输我s由寻址调节内吞作用和胞转作用途径的作用决定的。

引言

细胞屏障在体内充当外部环境和内部隔室之间的网关。这是上皮衬里分离胃肠（GI）道和血液^1-3的外部暴露表面上的情况。细胞屏障也代表了血液和软组织及组织和器官的细胞成分之间的界面。这是用于在血管，如血肺屏障，血-脑屏障等在内的内皮衬里的情况下¹遍历这些细胞屏障在身体的能力对于有效递送治疗剂和诊断剂的关键为那些需要干预的循环和组织/器官。

以改善递送治疗或诊断剂，这些化合物可以被加载到亚微米的纳米载体（NCS）。这些药物递送载体可以与各种被配制化学和结构优化药物的溶解度，保护，药代动力学，释放和代谢^4,5。纳米晶也可官能化亲和或靶向部分（ 如抗体，肽糖，核酸适体等 ），以促进粘附到那里的治疗作用是必需的^2,6身体的区域。 NC的靶向表达的细胞屏障的表面上的决定可以进一步便于运输进入和/或在这些衬片^2,6。

两个环境之间选择性地运送物质的作用需要细胞间层的某些独特的功能。一个这样的功能是细胞极性，从 ​​而面临着腔的内腔的顶膜从基底外侧膜面向组织间质的变化时，相对于膜的形态和脂质，转运蛋白，受体和²的组合物。另一个特点涉及到细胞间junctioNS连接相邻细胞。形成紧密连接，特别是连接粘附分子（卡纸），occludins和claudins蛋白的调节，调节的屏障功能，以选择性地允许或没有的细胞，称为细胞旁转运之间的物质运输，允许材料从内腔通道到基底外侧空间^3。许多天然的和合成的元素（白细胞，分子，粒子和药物递送系统），以在体内细胞屏障的结合可诱导细胞结开口，这可能是短暂的，相对无毒或更长时间的，因此，与不安全的访问跨越障碍^2,5,7-9不需要的物质。因此，该途径可通过测量跨上皮电阻（TEER）和分子的被动旁细胞扩散（在本文中称为旁泄漏）进行评估，从而阻力下降到的电流或INE的增加细胞旁漏RT复合成的基底空间指示开幕细胞交界处，分别为^5,10,11。为了配合这些方法，任何上面列出的紧密连接蛋白的可染色，以评估其诚信，染色的地方应该会出现集中在细胞与细胞边框四周的细胞外围^5,10,12。

可替换地，药物递送系统针对特定的细胞表面决定簇，如那些相关联的网格蛋白小窝或烧瓶形膜内陷称为小窝，可能引发水泡性口摄取到细胞通过内吞作用，提供了一个途径药物递送至细胞内区室^{5， 13。}此外，细胞内吞作用可能导致拐卖整个细胞体囊泡释放的基底侧，这种现象称为transyctosis，或跨细胞运输^14。因此，内吞作用的动力学和机制的知识可能被用来利用细胞内的一个ND跨细胞给药，它提供了一个相对安全和控制下交付模式相比，旁路线。内吞作用的机制可能与经典途径（网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用）或者非经典途径的调节剂进行评估（如细胞粘附分子的情况下（CAM） -介导的胞吞作用^）5,13,15 。

而细胞内运输往往是研究标准井或盖玻片，没有一个基底室的排除细胞极化，研究运输跨越细胞层的能力。为了克服这个障碍，跨细胞单层转运已久使用Transwell小室^{10,11,16,17，}它由一个上（顶）腔室，一多孔可渗透膜，其中细胞附着和形成紧密的单层和下研究（基底）室（ 图1）。在这种结构中，运输可以在被测量心尖​​至基底外侧通过施用治疗入上腔体，通过细胞单层，并在下面的多孔膜下面的运输，并最终收集培养基中的下腔室用于输送物料的定量方向。运输在基底外侧至顶端的方向也可以通过最初给药测定从上部腔室^5,10,12,16的下部腔和随后的集合。各种技术存在以验证渗透性屏障的上转孔，包括TEER和细胞旁转运测定法形成的，如上面所述。此外，可渗透的过滤器上的细胞进行培养可用于成像分析（ 例如，通过荧光，激光共聚焦，电子显微镜）被除去，因为该细胞单层模型的进一步验证，以及传输的机制。选择膜类型，它可在不同的孔尺寸，材料和表面区域的，​​取决于各种实际RS诸如物质的大小或者被运送的物体，细胞类型和成像方法^16,18-20。 Transwell小室也便于控制和准确的运输量化比较复杂的哺乳动物系统中，作为商会和细胞表面积体积是已知常数。而参与体内输送许多因素被消除，包括肠粘液的存在，剪切应力，消化酶，免疫细胞等 ，这种小规模的体外模型提供有关运输有用的初步信息。

作为一个例子来说明这些方法的适应性研究数控运输跨越细胞屏障^{10,11,16,17，}我们在这里描述的地方为整个胃肠道上皮细胞的NC迁移的潜力为蓝本通过评估模型药物输送通道的情况下系统通过人上皮结肠直肠腺癌（Caco-2细胞）的细胞单层。为了这个目的，C细胞l培养于Transwell小室，在0.8微米孔径的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的过滤器（6.4毫米直径），它是透明的，并且可以用于显微镜成像。渗透性屏障的状态，通过测量TEER，控制物质，白蛋白，并且紧密连接，occludin的蛋白中的一个元素的荧光显微镜目测的心尖至基底外侧运输进行了验证。有针对性的聚合物数控的模型时，由100纳米，生物降解聚苯乙烯纳米颗粒。纳米晶是由表面吸附有单独的靶向抗体或靶向抗体的结合和治疗的货物，其中任一组分可以被标记^{的125 I}放射性同位素示踪包衣。在选定实施例中，所述抗体识别细胞间粘附分子-1（ICAM-1），蛋白质胃肠上皮的表面上表达（和其他）细胞，其已经显示出促进细胞内和跨细胞转运ö f药物载体及其货物^21。货物是α-半乳糖苷酶（α-半乳糖），用于治疗法布里病，一种遗传性溶酶体贮积症²²的治疗酶。

该涂层NC的大小约为200纳米，被添加到心尖部室对细胞单层培养在37℃期限不同的时间，在这之后¹²⁵我对NC的可检测相关的细胞单层和/或输送到下面的细胞基底外侧腔室。额外的决心免费¹²⁵我的允许涂层数控运输的退化分数和估计的减法。传输的机制是通过检查变化有关的细胞旁路线的通透性屏障，通过上面描述的参数，而跨细胞运输是通过调节内吞和胞转的通路时，检查改变传输确定进一步评估。

ontent“>这些方法提供关于蜂窝障碍模型的有价值的信息，药物递送系统的运输的程度和速率，并且这样传输的机制，完全允许跨细胞屏障的药物递送的潜力的评价。

研究方案

1。培养在Transwell小插入一个细胞单层

1. 在无菌，生物安全2级细胞培养罩，放置0.8毫米毛孔的PET Transwell小室在24孔板（4每口井条件，统计显着性），用血管钳。所有进入罩的材料应与消毒乙醇。

注意：需要的过滤器的孔径，在符合被选择为在NC中使用的平均尺寸，从而使运输穿过细胞膜。另外，对于显著结果，各实验条件需要相同的实验中的最低的4个重复（孔），和至少3个独立实验。

2. 制备含有补充用4.5克/升葡萄糖，15％胎牛血清和1％青霉素链霉素的DMEM培养基的细胞培养液，并加热至37℃的水浴中。
3. 稀人上皮大肠腺癌（Caco-2细胞）细胞在细胞培养基和地点200-400微升的细胞溶液进入的transwell插入物的上（顶）室，在1.5×10 ⁵个细胞/ cm ²的密度。 900微升细胞培养基 - 700填补较低（基底）室。
4. 培养细胞在37℃，5％CO ₂和95％湿度下16-21天，更换在上部和下部腔室中的介质，每3-4天，使用在步骤1.3所表示的体积。从下腔室吸出培养基，从上部腔室吸出培养基，注入新鲜的培养基中的上腔室，并填入下部腔室有：在以下，以保持上述（而不是下面）细胞单层中的压力取代介质新鲜培养基。

2。胃肠上皮通透性屏障使用跨上皮电阻（TEER）和免疫染色紧密连接的验证

1. 对于短期存储（不超过2个星期），淹没STX100电极在电解质溶液化（0.1-0.15米氯化钾或氯化钠）。电极电缆连接至EVOM电压电阻计电极端口，以便该系统是内部短路和电极对称性保持不变。对于长期储存，冲洗用DH ₂ O和存放在干燥，避光条件。
2. 消毒电极，浸入在乙醇中15分钟，并允许在空气中干燥15秒。或者，所述电极可以被存储在一个紫外线罩。冲洗电极在无菌电解质溶液（磷酸盐缓冲盐水，PBS）或0.1-0.15摩尔KCl或NaCl溶液中，每个电阻测量之前。
3. 用伏特 - 欧姆计设定为电阻设置，垂直放置的电极在井含有的transwell插入物，具有在上部腔室的短电极和在下部腔室触及孔底部的长电极。每口井;一旦EVOM读数稳定后，记录电阻值（Ω（欧姆）给出）。
4. 计算电阻率（resistanCE归区域;厘米^2）减去背景阻力Transwell小室无细胞（TEER）和膜表面积乘以样本Ω×。电阻率值是最经常在文献中报道。 （见讨论）
5. 重复测量，每隔1-2天，直到TEER值上升到最高和高原，表明形成了渗透屏障，它通常需要2-3周的细胞编结的时刻。高原TEER值和必要的时间来实现屏障的完整性可以根据细胞传代次数而变化。
6. 以验证紧密连接的细胞单层的存在下具有高的TEER（等于或大于为势垒形成的阈值）时，通过培养用冷的2％多聚甲醛固定15分钟，固定细胞。然后，在室温下用1微克/毫升抗紧密连接蛋白用PBS洗涤细胞，并培育他们30分钟。用PBS再次洗涤细胞，并用7.5微克/毫升f孵蛋30分钟，在室温下luorescently标记的第二抗体。使用井低TEER作为阴性对照屏障的形成。

注意：作为一个替代的抗紧密连接蛋白中，可以使用抗体来替代紧密连接蛋白。

7. 仔细切除其上固定单层附着在过滤膜，并安装使用上或落射荧光共聚焦显微镜载玻片成像。

3。评估目标的载体跨上皮转运

1. 标记的靶向抗体（小鼠单克隆抗ICAM-1抗体，抗ICAM，在这个例子）与¹²⁵ I，如前所述^7。标记抗体的使用Bradford测定法来估计蛋白质浓度和γ计数来确定该抗体^{的125 I}含量，然后计算出在每分钟（CPM）的计数的比活性/毫克。

注：为了控制特异性，重新通过标记小鼠IgG，这将被用于制备非靶向涂覆纳米晶泥炭的过程。研究的治疗性货物运输，在本例中重复该步骤标记的货物，例如，α-半乳糖苷酶（α-半乳糖）。替代方案可用于靶向剂，非特异性对照，或治疗性的货物。可供选择的方法也可以用于标记的化合物和估计的标记对应的浓度。

2. 夫妇标记靶向抗体（抗ICAM在我们的例子），以纳米晶的表面。在这个例子中，孵育聚苯乙烯纳米珠（100纳米直径）为1小时，在室温下，用¹²⁵ I-抗ICAM允许表面吸附，如所描述^7。

注：对于非特定的控制使用¹²⁵ I-IgG抗体。要跟踪货物的运输，使用靶向抗体和¹²⁵ I标记的货物（α-半乳糖在我们的例子）的组合。

3. 离心机以13,000×g离心3分钟，并通过抽吸除去上清液中的未涂覆的同行。重悬含有用1％牛血清白蛋白（BSA）的PBS中通过移液，超声在低功率扰乱潜在的颗粒聚集体（20-30简要脉冲）涂覆的纳米晶沉淀。
4. 数控表征，测量尺寸，多分散性，和使用动态光散射（以下供应商的说明）涂覆颗 ​​粒的ζ-电势，和量化的数的¹²⁵ I-标记的在粒子表面上靶向抗体分子（ 如抗ICAM），使用伽玛计数器。

注意：这些方法可以被重复用于非特异性和治疗的同行。大约200纳米涂覆的颗粒的尺寸范围内。

5. 加入¹²⁵ I-NC的抗体，（ 如 ¹²⁵ I-抗ICAM纳米晶; 56 NCI /毫升），以上述融合的Caco-2细胞单层与跨膜电阻及上腔＃8805; ^350Ω×2厘米（见讨论）在背景（16-21天后播种）。在37℃下的一个或多个所需的时间间隔。之前和之后孵育测量TEER（第2.3节），以评估NC的对渗透性屏障的作用。

注意：此过程可以重复进行非特异性和治疗的同行。

6. 从上，下腔收集培养基，于37℃（上院）或1毫升DH _{2 O（}下腔）用0.5毫升的DMEM一旦把它们洗干净。用γ计数器收集洗涤液总放射性同位素含量的测定。
7. 对于细胞级分进行测定，用剃刀刀片切割的边缘，并孵育在γ计数管，用1％的Triton X-100的10分钟（以释放细胞内容物），测定细胞前切除的透气性过滤器， 例如相关的总放射性。
8. 为了测量¹²⁵我重新在运输过程中的NC或租赁由于潜在的降解，第一混合300微升的样品（从上，下，或细胞级分）与700微升PBS中的3％BSA和200微升三氯乙酸（TCA）。在室温下孵育15分钟。另外此时，测量该样品的在γ计数器中的总放射性。
9. 离心机TCA样品在3000×g离心5分钟，以从蛋白质降解或^{125 I}部分（上清液）分离完整蛋白质（粒料）。量化免费¹²⁵我分数的放射性和减去总放射性这个值离心前测量。这将提供标记的蛋白质的未降解的量。

4。靶向纳米载体的跨上皮转运机制

1. 标签在3.1节中描述并预先用^{125 I}白蛋白报^7。

注：白蛋白是66.5kDa的蛋白质，因此，相对大的物质。虽然较大的对象（例如200 nm的纳米晶用在这里）的被动转运有效的控制，应该学习较小的药物载体转运时被较小的惰性示踪剂分子（见讨论）。

2. 使用白蛋白旁漏，培养的Caco-2细胞单层上，如上所述的transwell插入物评估细胞旁转运。
3. 到上面的细胞单层上腔介质，添加或¹²⁵单独的I-白蛋白（阴性对照，显示泄漏的基础水平），或¹²⁵ I-白蛋白和非放射性标记的抗体靶向纳米晶（如在第3.5节中所述）。在37°C为选定的时间间隔（S），这应与测试数控交通工具时检查。前测量TEER（2.3节），在此期间，和孵化后，然后收集所有组分总¹²⁵我和免费¹²⁵ I测量所示，第3节中说明：伴随另外的¹²⁵ I-白蛋白和非放射性标记的对照IgG纳米晶可以被用作对照。
4. 作为阳性对照用于打开间连接中，添加含细胞介质5mM的H _{2 O 2}到Transwell小插入物的上部和下部腔室，并在37℃下进行30分钟。然后，测量TEER（2.3节），并加入¹²⁵ I-白蛋白选定的时间间隔上院。测量TEER在整个孵化不同的时间点，以确定引起H _{2 O 2}诱导的开幕细胞连接的TEER值衰减。
5. 在平行实验，评估跨细胞运输，也被称为胞转^，125 I-NC的针对性孵化融合的Caco-2细胞单层带为50微米monodansylcadaverine（MDC;抑制网格蛋白介导的内吞作用），1微克/毫升律平（抑制剂胞膜窖介导的内吞作用），0.5μM沃特曼在（抑制剂的磷脂酰肌醇3激酶PI3K]，参与巨胞饮作用），或20μM的[5 - （N-乙基-N-异丙基）阿米洛利]（EIPA，抑制剂巨胞饮作用和CAM介导的内吞作用^15）。

注意^：125 I-IgG的纳米晶和¹²⁵ I-白蛋白可作为对这些抑制剂的作用阴性对照，以及其他方法（例如siRNA的技术），可以提供更多的选择性抑制。

6. 测量TEER之前（第2.3节），在此期间，与细胞抑制剂和放射性材料的温育后，作为一个额外的控制的抑制剂在单层通透性的影响。

结果

作为我们的细胞模型，研究对象NC的跨上皮转运的验证， 图2示出的Caco-2细胞单层镀以1.5×10 ⁵个细胞/ cm ²的密度达到汇合〜第12天，并保持单层完整性达18天，通过跨膜电阻（ 图2A）表示。这是由occludin的阳性紧密连接的细胞单层用高TEER（390Ω×cm ²时，第14天）的存在（ 图2B）进行验证，相比于低TEER差的紧密连接标记（17Ω×cm ²时...

讨论

使用上面讨论的方法中，细胞模型用于研究跨细胞屏障靶向NC的传输可以被建立，例如提供的Caco-2上皮细胞，这是有关从GI管腔评价运输到血液中的情况下的示例的口服药物传递系统。胃肠道上皮细胞单层在Transwell小室培养启用TEER的测量和紧密连接的荧光免疫染色，以确认形成的细胞渗透屏障。随后，定位和治疗药物的¹²⁵単我提供了有针对性的纳米晶的快速，灵敏的定量成和整个胃肠道细...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90