微RNA<em&gt;原位</em&gt;杂交的福尔马林固定的肾组织

摘要

本文介绍了比色法检测福尔马林固定的肾部分microRNA表达谱进行优化的原位杂交协议。

摘要

在本文中，我们通过与地高辛原位杂交描述了在肾脏比色法检测miRNA的方法标记的小分子RNA探针。这个协议中，最初是由Kloosterman和同事们用Exiqon miRNA探针¹广泛使用而开发的，已被修改以克服固有的miRNA分析在肾组织中的挑战。这些包括诸如结构识别和难以除去残留的探针和抗体。使用比较薄的，厚5毫米，可清晰肾脏结构的可视化，同时强大的探测信号被保留在细胞组织切片。此外，探针浓度和培养条件进行了优化，以方便与低背景和非特异信号的microRNA表达谱的可视化。此处，优化的协议进行了说明，通过幻灯片在该过程结束时，安装覆盖所述初始组织收集和制备。其基本组件管理此协议的NTS可以改变应用到其它组织和细胞培养模型。

引言

微RNA是小（约22个核苷酸长），非编码所产生的内源性的RNA。他们一般通过功能翻译抑制或mRNA降解，抑制蛋白的表达。的miRNA结合到靶mRNA不完全互补，从而有可能为一个单一的miRNA抑制多个目标。

了解哪些类型的细胞和结构表达的miRNA是理解机制的重要组成部分，通过它在miRNA的表达影响细胞和组织表型的改变。而方法如miRNA的测序，定量PCR和Northern杂交可用于检测在整个组织中的miRNA，这种方法不允许之一，以确定哪个特定的细胞类型，他们从一个给定组织中来了。使用这些方法和蜂窝结构成分分析之前夹层可以是非常困难的，以获得足够的隔离度所需的条件能导致人terations在基因表达或RNA的降解。微小RNA 原位杂交是用于可视化组织中微小RNA的位置和表达水平的方法。这种技术是在组织异质结构，如肾组成的特别有价值。

小分子RNA已被证明发挥肾脏发育^2,3和生理学⁴的调节作用。微小RNA表达的改变也被证明参与与肾脏病理如纤维化^5-10，糖尿病肾病^7，肾癌^11,12，和急性肾损伤^13。在我们的研究中，我们已经发现， 在对肾组织原位杂交优化微小RNA是用于确定miRNA的表达在健康和疾病¹⁴的确切结构的位置有价值。不同的microRNA的管状和细胞表达的测定是很重要的，因为TA自己调节rgets可能依赖于细胞功能。在疾病状态也很重要，以确定如何在miRNA表达的改变可能影响功能。

这里描述的方法的目标是建立在由Kloosterman 等 ^15，其他研究者^16,17开发现有ISH方法，以及那些建议的Exiqon ¹和优化方法对福尔马林固定的肾组织。我们已经成功地使用这种方法来确定单侧输尿管梗阻¹⁸在肾小分子RNA的miR-382的表达明显的地区差异。这种方法可以与其他组织可以用作良好，额外的优化。

研究方案

1。肾组织切片

1. 福尔马林固定的（10％）的石蜡包埋的肾脏切片使用的是MICROM HM 355 S的幻灯片可以被存储以供分析前几个月切到显微镜载玻片上以5mm的厚度。

2。溶液的制备

1. 准备1升的1×PBS的在DDH _{2 O}在高压灭菌螺旋盖瓶。填写另一瓶1升双蒸₂ O的加入1 ml的DEPC到每一瓶，盖和剧烈震荡。让该溶液静置过夜，在室温下，以破坏RNA酶，然后高压灭菌。添加400毫升吐温20，以1升1×PBS中，使PBS-T。
2. 制备的蛋白酶K缓冲液（50 mMTris-盐酸，pH值8.0和1mM的CaCl ₂在DEPC处理的水）。
3. 制备在PBS-T中的0.2％的甘氨酸溶液。

3。组织准备

1. 准备大量的杂交缓冲液（50-100毫升）50％甲酰胺组成的，5×SSC，0.1％吐温，9.2mM柠檬酸调整pH至6，50微克/毫升肝素和500μg/ ml的酵母于DEPC处理过的RNA双蒸₂ O。划分为1毫升分装并储存于-80℃。
2. 在新鲜的二甲苯清洗3次，每次5分钟从组织中取出石蜡。
3. 通过5分钟的孵育在减少浓度的乙醇（100％，75％，50％和25％）在DDH ₂ O再水合的组织切片
4. 治疗载玻片用DEPC足够完​​全覆盖组织切片（约0.4-0.5毫升），持续1分钟。确保组织不干燥。
5. 漂洗DEPC幻灯片处理PBS-T两次5分钟，收集废物妥善处置含DEPC。所有试剂应DEPC处理，以消除RNA酶从这点上。
6. Prewarm蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K加至10微克/毫升的最终浓度。涵盖组织切片用蛋白酶K溶液和孵化在37℃下5分钟。
7. 快速去除proteinasËK溶液，并加入PBS-T 0.2％的甘氨酸，持续30秒。
8. 于DEPC冲洗玻片处理PBS-T两次，每次30秒。
9. 固定在新鲜配制的4％多聚甲醛固定切片10分钟。

4。杂交

1. 加50微升杂交缓冲液（50％甲酰胺，5×SSC，0.1％吐温，9.2 mM柠檬酸调整pH至6，50微克/毫升肝素，500微克/毫升酵母RNA）每组织切片，并盖上无RNA酶的HybriSlips切只是比组织切片大。
2. Prehybridize部分在湿度受控杂交烘箱中2小时，在杂交温度下测定的3'地高辛标记的探针（探针通常是DNA的Tm -21℃（ 即 54℃下的miR-382，探针DNA的Tm = 75℃ ），采用浸泡在50％formamide/50％5×SSC组织实验室擦拭，以保持腔室加湿。
3. 淡化miRNA的探针，阳性对照组（U6，小核RNA）和阴性对照（炒序列），以40nm的在杂交缓冲液（75微升缓冲液中的每部分需要的话）。
4. 热探针在杂交缓冲液中于65℃维持5分钟。
5. 从杂交烤箱中取出的幻灯片，并从预杂交取出盖玻片和多余的杂交缓冲液。
6. 加75微升每组织切片探针含有缓冲液，直接给组织。涵盖组织与HybriSlips只是大到足以覆盖的组织切片。
7. 保持滑架的水平，回归杂交炉过夜孵育温度从步骤4.2（约16小时）。

5。严格洗涤

1. 加入200μl2×SSC，加热到杂交温度，刚下盖玻片的一边，以帮助从组织中释放盖玻片。通过倾斜滑动取下盖玻片。
2. 在杂交温度3倍于200微升50％甲酰胺，50％的2倍SSC洗玻片各30分钟。
3. 冲洗载玻片5倍的PBS-T在室温下每5分钟对低速轨道摇床。

6。发现

1. 在封闭缓冲液（2％山羊或马血清，2毫克/毫升BSA的PBS-T）1小时，在室温下对低速轨道摇床孵育滑动。
2. 稀释的抗DIG-AP Fab片段在封闭缓冲液以1:100。添加每组织切片100微升，盖上HybriSlips切只是大到足以遮盖上述部位。
3. 孵育抗体在湿盒中4℃过夜（约16小时）。
4. 在PBS-T洗7倍的幻灯片，对于每5分钟在轨道摇床中于低速。
5. 在AP缓冲液冲洗载玻片（100mM的TrisHCl pH为9.5，50毫摩尔MgCl _2，100mM的氯化钠，0.1％吐温20）3倍，每次5分钟。
6. 加入NBT / BCIP解决AP缓冲液（200毫升μl/10缓冲区）
7. 加入400-500毫升稀释后NBT / BCIP解决方案，以每张幻灯片完全覆盖所有的组织切片。建立在一个黑暗的，水平，humidif灭蝇灯腔4-5小时。

7。安装滑轨

1. 在每个5分钟递增浓度的乙醇（25％，50％，75％，100％）脱水部分。
2. 在孵育二甲苯5倍，以清除部分。
3. 山滑入Permount安装介质和干燥过夜。

结果

在杂交中，孵育该变得干涸或一般洗涤步骤结束的NBT / BCIP发育过程中染色更暗的组织切片的区域， 图1示出了肾部分，其中HybriSlip滑落的边缘的一部分的组织，使之成为部分脱水。尽管补液和覆盖范围中的其余步骤，在脱水部分的信号是虚高。

控制NBT-BCIP发展的时间的重要性是体现在图2A和2B。比4-5小时，结果明显的非特异性显色的炒-MIR?...

讨论

本文的目的是描述了miRNA的原位杂交协议，在福尔马林固定的肾组织效果很好。虽然制定这个协议染色神器的几个重要来源已经确定。仔细注意这几点可以帮助避免染色神器，增加成功的ISH执行的可能性。

可以发生一个染色神器的最可避免的原因时，组织切片成为在漫长的孵化干涸。当此发生时变成干燥的组织部分将NBT / BCIP发育（ 图1）中染色很暗。在本?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
PBS	Gibco	70011044
Diethyl Pyrocarbonate	Sigma	D5758
Tween-20	Sigma	P1379
Xylenes	Sigma	534056
Ethanol	Ultra Pure	200CSPTP
Tris-HCl	Life Technologies	15506-017
CaCl2	Sigma	C2536
Glycine	J.T. Baker	4059-00
Citric Acid	Sigma	C2404
Formamide	Sigma	F9037
20x SSC Buffer	Life Technologies	15557-044
Heparin	SAGENT	25021-400-30
Yeast RNA	Life Technologies	AM7118
MgCl2	Sigma	M8266-1004
NaCl	J.T. Baker	4058-01
Proteinase K	Fermentas	EO0491
3’ DIG- miRNA probe	Exiqon	miR dependent-05
3’ DIG- Scrambled miR probe	Exiqon	99004-05
3’ DIG- U6 miR probe	Exiqon	99002-05
Anti-Digoxigenin-Ab Fab	Roche	11093274910
NBT/BCIP	Roche	11681451001
Permount	Fisher	SP15-500
Coverslips	Fisher	Fit to tissue size
Microtom HM 355 S	Thermo Scientific	23-900-672
In-slide Out Hybridization Oven	Boekel	241000
Aluminum Tray Assembly	Boekel	C2403973
Stainless Steel Rack Insert	Boekel	C2403754