芯片上的压力诱导抗生素易感性测试

摘要

我们开发了一个用于快速抗生素易感性检测的微流体平台。流体以高速通过在微流体通道底部固定的细菌。在压力和抗生素的存在下，易感菌株会迅速死亡。然而，耐药细菌可以在这些紧张的条件下存活下来。

摘要

我们已经开发出一种快速微流体方法，用于在压力型环境中进行抗生素易感性测试。流体以高速通过在微流体通道底部固定的细菌。在压力和抗生素的存在下，易感菌株会迅速死亡。然而，耐药细菌在这些紧张的条件下存活下来。这种方法背后的假设是新的：作为抗生素靶点的生化途径的压力激活可以加速抗生素易感性测试。与标准抗生素易感性检测方法相比，在抗生素应用过程中省略了限速步骤 - 细菌生长。该方法的技术实施是标准技术和创新方法的结合。该方法的标准部分包括细菌培养协议、多晶硅氧烷 （PDMS） 中的微流体通道定义、荧光细胞生存能力监测以及细菌计数的批量图像处理。该方法的创新部分是利用培养介质流进行机械应力应用，使用酶来损伤而不是杀死细菌，以及使用微阵拉基板进行细菌附着。开发平台可用于抗生素和非抗生素相关药物的开发和测试。与标准的细菌悬浮实验相比，该药物的效果可以在受控时间段内反复打开和关闭。在同一实验过程中，可以重复观察相同的细菌种群。

引言

细菌耐药性的上升加剧了对基于表型的快速抗生素易感性测试的需求，以保障我们药物的最终手段。标准易感性测试基于细菌生长抑制，在抗生素的存在下需要多个小时（8-24）小时才能完成。我们在一个微型流体平台上开发了一种新的抗生素易感性测试，该平台依靠生物合成途径的压力激活来加速抗生素的作用。

微流体规模的抗生素易感性测试具有有效样品使用的优势，因为它们需要少量细菌。此外，微流体设备可以多路复用，以便在多个条件下测试多个样本^1，2。最近，一些用于抗生素易感性检测的微流体方法被报道为^3-9。在这些方法中，细菌生长在纳米和皮奥利特液滴^3，7，在微流体通道^4-6，8的全体积，或作为单一细菌电局部到通道⁹的底部表面。虽然这些测试是在微流体通道中进行的，但它们都监测微生物在存在和缺乏与传统方法类似的抗生素时的增长。生长测量 通过 光学密度、pH敏感染料或明亮的场/相对比度或荧光图像进行。虽然其中一些测试比传统方法更快，但它们各自被动地检测抗生素耐药性。换句话说，这些方法仍然要求用户等待细菌生长作为最终读出。

相比之下，我们开发了一种利用剪切和酶应力相结合的方法来激活抗生素敏感的生化途径^10。用这些抗生素挑战压力细菌会产生更快的易感性测试。对抗生素有抗药性的细菌能够承受压力。另一方面，易感细菌会被....

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研究方案

1. 制作 PDMS 层（图 1）

1. 以10：1的比例大力混合PDMS和固化剂。为了去除气泡，在室温下将粘稠的混合物在真空室中分解1小时。
2. 在秤上，将 PDMS 缓慢地倒在铝模具上。从中心倒入，保持模具水平。请务必将引脚揭开。一旦达到目标重量，停止浇注。
   我们的模具需要 4 克 PDMS 和 0.4 克固化试剂。
3. 将模具放在烤箱内，并在 37 °C 的夜间固化。
   替代固化时间为 2 小时，60 °C 或 1 小时在 90 °C。
4. 沿着模具边缘解剖固化的 PDMS 层，然后用一对钳子小心地将其从模具表面剥落。用 70% 的乙醇和 Q 尖清洁模具表面。

2. 根据图 2 组装流单元

PDMS 的标准组装与玻璃滑梯通过氧气等离子体处理两个表面，确保 PDMS 和显微镜玻璃滑梯之间的无泄漏粘合。在所提出的协议中，等离子处理将破坏玻璃滑梯上的化学涂层。因此，滑梯是压力密封的，而不是血浆处理。

1. 将玻璃窗放入流动单元袋中。
2. 将涂层玻璃滑梯放在流动单元口袋内的玻璃窗上，将活动侧向上放置 PDMS 层，上面有面向下的通道。将 PDMS 滑动置于通道输入与金属板中的通孔对齐的方式。轻轻地将空气从两层之间推出。
3. 翻转 PDMS....

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结果

图4中提供的数据表明，在含抗生素的微流体通道中，金黄色葡萄球菌菌株会随着时间而发生反应。在 1 分钟和 1 小时实验结束时获得的相位对比图像显示在图 4A和B中。分析的 1 小时数据以图 4C显示，细菌以红色突出显示（共 5，828 个）。相应的荧光图像显示在图4D和E中。分析的 1 小时数据显示在图 4F.......

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讨论

在一组对甲氧西林敏感和耐甲氧西林金 黄色葡萄球菌 株¹⁰的实验中，对所提出的协议进行了验证和优化。因此，该协议未经修改应直接适用于其他菌株的 金黄色葡萄球菌 和其他抗生素与影响细菌细胞壁生物合成的行动机制。 除金黄色葡萄球菌外，细菌类型可能需要压力参数的变化：可溶性（酶）和机械应力。如果在葡萄 球菌 以外的细菌物种的测试中需要可?.......

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SYTOX Green	Invitrogen Corporation	S7020	Dead cell fluorescence stain
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, Inc	A9418-5G	Used for lysostaphin storage
Sodium Acetate	Sigma Aldrich, Inc	S8750-500G	Used for lysostaphin storage
Lysostaphin	Cell Sciences	CRL309A	Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml  lysostaphin for storage
Oxacillin salt	Sigma Aldrich, Inc	28221-1G	Antibiotic
Mueller Hinton Broth	Fisher Scientific	DF0757-17-6
Sodium chloride	Sigma Aldrixh	S3014-500G	2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving
1 ml, Luer-lock syringe	BD (Beckton, Dickinson and Comp.)	14-823-2F
2 oz, Luer-lock syringe	BD (Beckton, Dickinson and Comp.)	309653 - 60 mL	Overfill to ~65 ml
Microscope
Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70	Cambridge Scientific	9349
60X, Fluorescence/Phase contrast objective	Olympus Corp.	LCPlan F1 60x/0.70 Ph2
Retiga 12-bit monochrome CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12-C
Microscope automation
Shutters phase contrast/fluorescence	PRIOR Scientific	H204/H202
X/Y Stage	PRIOR Scientific	H107AENN
Focus motor	PRIOR Scientific	H122
Joystick for XYZ control	PRIOR Scientific	CS152EF
Proscan Controller	PRIOR Scientific	H3-XY2
Image Acquisition Software	Fraunhofer CMI
Flow Cell Assembly and PDMS
Flow Cell	BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI	3333-1044	Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI
Glass window	Fraunhofer CMI	3333-1054	Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI
BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm	Edmund Optics Inc.	NT48-543
Sealing plate	BU Scientific Instruments Facility	3333-1045
Epoxide glass slide	Arrayit Corporation	SuperEpoxy 2
PDMS master	Fraunhofer CMI	3333-1053	Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)
PDMS slide design	Fraunhofer CMI	3333-1053
Tubing
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green	IDEX Health Science	M-644-03	Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule
Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black	IDEX Health Science	M-657
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural	IDEX Health Science	P-255
Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow	IDEX Health Science	P-259	Fits Luer-lock adapter
Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green	IDEX Health Science	1520G
Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red	IDEX Health Science	P-658