高通量流式细胞仪检测细胞为基础的试验检测抗体，以N-甲基-D-天冬氨酸受体或多巴胺2受体在人血清

摘要

在最近几年，活细胞检测已被成功地用于检测抗体的表面和构象的抗原。在这里，我们利用高通量流式细胞仪使的患者大样本的分析描述的方法。检测新抗体将提高诊断的免疫介导的病症和治疗。

摘要

在最近几年，抗表面和参与神经传递构象的蛋白已在儿童和成人自体免疫CNS疾病检测。这些抗体已被用于指导诊断和治疗。基于细胞的测定具有改善的抗体在患者血清中的检测。它们是基于大脑的抗原上的真核细胞中，然后将其用稀病人血清随后荧光标记的二抗温育的表面表达。洗涤后，将二级抗体结合通过流式细胞术，然后进行分析。我们的小组已经开发出一种高通量流式细胞仪活细胞为基础的检测可靠地检测抗体的特异性神经递质受体。这种流式细胞仪的方法是直接的，定量的，高效的，并且使用高通量采样系统允许大量患者组可以很容易地测定在很短的时间空间。此外，这种细胞系作为说可以容易地适用于检测抗体，以许多不同的抗原靶，无论是从中枢神经系统和外周。发现更多的新型抗体的生物标志物，使迅速和准确的诊断和提高治疗免疫介导的疾病。

引言

近年来，中枢神经系统（CNS）疾病的自身免疫性形式也已确定。它已经表明，这些疾病相关联，并且由自身抗体的存在来定义。这些抗体结合到神经元的受体或参与神经传递^1,2突触蛋白。不同的抗原已被检测到，如N-甲基-D-天冬氨酸受体^{（NMDAR）3-5，γ-}氨基丁酸B受体（GABA _B）受体^6，α-氨基-3 -羟基-5 -甲基-4 -异唑丙酸（AMPA）受体^7，电压-门控钾通道（VGKC）相关的蛋白质：富含亮氨酸胶质瘤活化蛋白1（LGL-1）和contactin相关蛋白^{2（capsr2）8,9，}谷氨酸受体^5,10和多巴胺-2受体^{（D2R）11。}在过去，这些自身免疫CNS障碍（主要是所谓的脑炎）往往确诊和治疗。这些新型抗体的生物标志物， 如：NMDA受体抗体或抗体D2R，大幅提高了诊断和认识，并已打开患者的治疗方案。事实上，随着免疫治疗早期治疗与改善预后^11,12关联。

传统的方法来检测抗体，如酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫印迹实验已用于检测血清中的抗体。然而，他们不容易使识别的细胞外或表面抗原决定簇和，相反，可能揭示免疫反应对细胞内抗原决定簇。此外，结合到所涉及的神经传递相关的重要蛋白质的胞外域的抗体很可能是致病^{2,3,7,13,14。}因此，准确和灵敏的分析方法的发展，以发现相关的细胞表面或细胞外的患者抗​​体的目标是至关重要的。在该领域的金标准方法是基于使用活细胞，在所谓的“细胞巴sed的分析“。此方法涉及一种抗原的表达在哺乳动物细胞（最经常的人胚肾293（HEK293）细胞）中的天然形式由含有感兴趣抗原的完整cDNA序列的载体转染的表面上。然后活nonpermeabilized细胞与稀释的患者血清和随后的荧光染料标记的抗人免疫球蛋白（Ig）的第二抗体。荧光的强度或电平然后检测并关联到自身抗体结合的程度。这种技术是特定的，因为只有一种抗原的过度表达在细胞中。最广泛使用的“读出”已经经过免疫^4,5,8-10共聚焦显微镜分析。然而，流式细胞术基于细胞的测定法已成功地用于检测抗体的患者的脱髓鞘疾病^15-17。特别是，水等 ¹⁵相比抗体的检测用锅的抗体的检测技术，包括基于细胞的测定接着显微镜或流式细胞仪EL分析，并且已经示出流式细胞仪的基于细胞的测定法是最灵敏，准确，可靠的方法。因此，流式细胞术基于细胞的测定是有利的，因为它是定量的，不研究者依赖性的，并且不涉及任何利用放射性物质。这也是方便，因为它允许较大的患者群在很短的时间量来测定。

最近，我们已进行了优化的高通量流式细胞术基于细胞的测定，以检测NMDA受体抗体和D2R抗体在自身免疫性疾病，中枢神经系统^11。我们小组最近利用流式细胞仪细胞分析检测NMDA受体抗体在病人血清。这些NMDA受体抗体阳性血清，使用共聚焦显微镜分析的先前和也被发现是阳性^11。这个协议概括了流式细胞术基于细胞的测定为C的检测onformation敏感的CNS抗体在患者血清中，利用一个自动化的高通量采样器。

研究方案

1。亚克隆策略构建的pIRES2-EGFP载体编码D2R或NMDA受体

1. 获得人类D2R或NMDA受体亚单位1（NR1）的全长cDNA克隆。
2. 选择的表达载体，如质粒pIRES2-EGFP，这是适合于跨膜蛋白，具有增强的绿色荧光蛋白在内部核糖体进入位点（IRES）的控制（GFP）的报告，使两种抗原和GFP中被共表达的表达细胞分开。
3. 内的pIRES2-EGFP载体亚克隆人cDNA。
   1. 亚克隆的cDNA，用适当的限制性内切酶（例如的NheI和XhoI人类D2R的cDNA）。
   2. 受限制的pIRES2-EGFP载体内结扎切断的cDNA插入。
   3. 序列连接的pIRES2-EGFP D2R或NMDA受体载体来检查向量是否包含正确的顺序。
   4. 净化和放大的pIRES2-EGFP D2R或NMDA受体载体转染后用。

书名“> 2。HEK293细胞转染的神经元抗原的表达

1. 培养HEK293细胞在组织培养瓶中用新鲜的Dulbecco改良的Eagle培养基（1X）（DMEM）中完全用4.5 g / L的D-葡萄糖，L-谷氨酰胺和110mg / L丙酮酸钠补加有10％胎牛血清（FBS）， 2毫米的GlutaMAX，和50微克/毫升庆大霉素。
2. 用胰蛋白酶和转移到锥形管分离HEK293细胞。
   1. 通过在250×g离心6分钟离心细胞洗涤并重新悬浮在新鲜的完全DMEM培养液将细胞沉淀。
3. 计数细胞和种子6孔板中在大约8×10 ⁵个细胞/孔，并培养过夜2毫升的DMEM，在37℃和5％CO ₂的培养箱中。
4. 一旦它们达到约70％汇合时，转染的HEK293细胞与质粒pIRES2-EGFP NR1（HEK293 ^{NMDAR +}细胞），质粒pIRES2-EGFP D2R（HEK293 ^{D2R +}细胞）和质粒pIRES2-EGFP（HEK293 ^CTL细胞;矢量控制），如下所示。稍后继续对一些未转染的HEK293细胞进行赔偿。
   1. 制备转染混合物，其包含2.5微克的DNA中加入200μl0.9％的氯化钠和4微克/毫升的聚乙烯亚胺/孔（每含2ml新鲜的完全DMEM）中的所需的体积。
   2. 立即旋涡振荡混合10秒和孵化在室温（RT）10分钟，加入转染混合物的体积，以适当的井前。
   3. 覆盖板，敷用封口膜的两侧，并离心分离，在280×g离心5分钟，以帮助细胞转染。
   4. 除去封口膜，然后在孵化器的地方文化在37°C
   5. 18小时后用新鲜完全DMEM更换培养基，并在文化保持另外72小时。
   6. 可选：72小时转染后，转染的细胞可以通过培养在完全DMEM补充有250微克/毫升遗​​传霉素选择的，以便获得多克隆稳定转染。

3。流式细胞仪检测细胞为基础的检测方法抗体的神经元表面抗原

1. 分离HEK293 ^{NMDAR +，HEK293 D2R +，}和HEK293细胞^的CTL孵育，用500μL/孔的Versene约5分钟，在37℃下
   1. 重悬在2ml/well的PBS（ -的Ca ^{2 +} /-Mg ^{2 +}的）补充有2％FBS（PBS / FBS）中，并转移到15毫升或50毫升的锥形试管中。
   2. 通过离心分离，在250×g离心6分钟洗涤细胞，重悬细胞沉淀在15-50毫升PBS / FBS中。重复洗2倍。
   3. 计数细胞，然后悬浮在PBS / FBS的以1×10 ⁶细胞/ ml。
2. 设计的96孔模板进行流式细胞术获取，考虑到HEK293 ^{D2R +}或HEK293 ^{NMDAR +}细胞，以及HEK293细胞^的CTL将必须与每个患者样本或初级抗体一起温育。
3. 种子细胞在V形底96孔板中以50,000细胞/我们LL根据流式细胞仪采集模板的流动。
4. 通过离心96孔板中，在450×g离心5分钟，并轻轻地用电子或手动多道移液器除去上清液，于一角度倾斜板，并小心不要吸出细胞沉淀沉淀细胞。
5. 培养HEK293 ^{D2R +，HEK293 NMDAR +，}和HEK293细胞^的CTL 1小时在室温下与黑暗：
   1. 第一抗体，以评估抗原的表面表达的系列稀释。
   2. 为了检测抗体的患者样品。
6. 使用适当的流式细胞仪检测补偿控制， 例如 。未染色的未转染的HEK293细胞中，GFP ⁺ HEK293细胞（AF647 ^{- ）}和未转染的AF647 ⁺ HEK293细胞（GFP）。
7. 通过离心分离，在450×g离心5分钟，洗涤细胞，重悬细胞沉淀在170微升PBS / FBS中。重复洗涤步骤两次以上。
8. 孵育细胞1小时R最快室温在黑暗中以1:100稀释AF647-标记的二抗（抗人IgG对患者血清和抗小鼠IgG抗-NR1或抗D2R初级抗体）。
9. 洗涤细胞三次，如在步骤3.7，并重新悬浮于35微升PBS / FBS的流式细胞术细胞采集。
10. 设置在流式细胞仪（BDLSRII）流动的高通量采样器（HTS）。
11. 获得10,000个事件/孔根据流式细胞仪采集模板的流程。
12. 导出，然后分析数据，使用流式细胞仪软件包，如FlowJo V7.5分析：
    1. 首先，基于前向（大小）和侧面（粒度）门活HEK293细胞分散。
    2. 基于高GFP-阳性分析仅转染的细胞进一步栅极活的HEK293细胞。
    3. 确定活GFP阳性细胞内的AF647信道的平均荧光强度（MFI）。
    4. 数据导出到Excel或棱镜进行分析：
       1. C区初级抗体（抗NMDA受体或抗D2R抗体）相对于MFI的oncentrations从孵育这些抗体的细胞获得。
       2. 对于每一个病人和对照样品，减去从HEK293 ^{D2R +}或^NMDA受体的HEK293 ⁺细胞，小额信贷机构分别HEK293 ^CTL细胞的MFI确定ΔMFI。
       3. 通过将上述控制队列的平均ΔMFI三个标准差计算抗体阳性的门槛。
       4. 情节个别样品根据其血清类型分组上的曲线图，并表示所述阈值作为线。

结果

购入住HEK293 ^{D2R +}和HEK293细胞^的CTL在流式细胞仪中使用的高通量采样器。在分析过程中，细胞是基于前向散射（大小）和侧向散射光（粒度）参数（ 图1A和1D）门控。转染的HEK293细胞中表达的报道分子，绿色荧光蛋白，在细胞质中，与未转染的细胞被排除在分析（ 图1B和1E）。内的GFP ⁺栅极，与AF647-标记的抗人IgG第二抗体结?...

讨论

本文介绍了一种新的应用流式细胞仪活细胞为基础的检测，以检测针对特定的细胞表面蛋白神经元使用高通量采样抗体。使用这种技术，我们报告说，受影响的自身免疫性中枢神经系统疾病的患者亚组有血清抗体表面NMDA受体或地表D2R。

使用这种高通量流式细胞仪活细胞为基础的检测为最佳的抗体检测的基本步骤包括：1）获得高产量的健康转染的细胞，2）验证高细胞表面所?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
pIRES2-EGFP vector	Clontech	6029-1
Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA	Missouri S&T cDNA Resource Centre	DRD020TN00
Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA			Gift from Prof A. Vincent  (Oxford, UK)
Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1)	BD Pharmingen	556308
Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11)	Sigma-Aldrich	WH0001813M1-50UG
Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L)	Invitrogen	A31571
Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L)	Invitrogen	A21445
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate	Invitrogen	11995-065
Foetal bovine serum	Invitrogen	10099-141
Gentamicin	Invitrogen	15710-072
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Geneticin	Invitrogen	10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)	Invitrogen	14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol Red	Invitrogen	12605-028
0.9% Sodium chloride	Baxter	AHF7975
Polyethylenimine	Polysciences Inc	9002-98-6
Versene	Invitrogen	15040-066
XhoI	Roche	10899194001
NheI	Roche	10885843001
PureLink PCR Purification Kit	Invitrogen	K3100-01
JetQuick Gel Extraction Spin Kit	Genomed	420050
T4 DNA Ligase	Roche	10481220001
Plasmid Plus Maxi Kit	Qiagen	12963
Name of Equipment/Software	Company	Catalog Number	Model/Version
Flow cytometer with high-throughput sampler system	BD Biosciences		BDLSRII with HTS
Inverted microscope	Olympus		CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply)
Electronic multichannel pipette (15-300 μl)	Eppendorf	613-2240P	12-channel Xplorer Plus
Excel	Microsoft		2010
Prism	GraphPad Software, Inc.		v4
FlowJo	Treestar		v7.5
50 ml polypropylene conical tubes	BD Biosciences	352070
6-well plate	BD Biosciences	353046
Tissue culture flask (T75)	BD Biosciences	353136
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-992
V-bottom 96-well plate	Corning	651180