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摘要

李斯特菌是一种革兰氏阳性细菌病原体常作为细胞内寄生的研究的主要模型。后期成像L.菌的小干扰RNA的屏幕范围内感染阶段允许所需的靶宿主细胞的细菌感染的细胞通路的全球研究。

摘要

细菌细胞内病原体可以设想作为分子工具来剖析，由于其能力，以精美的操纵和颠覆所必需的宿主靶组织感染细胞功能的细胞信号级联。在这些细菌病原体， 李斯特菌是，已被用来作为一个范例为细胞内寄生的细胞免疫应答的表征一种革兰氏阳性微生物，并且其在分子通路控制细胞骨架和膜运输动力学的发现发挥大的作用。在这篇文章中，我们描述了一个强大的显微镜测定法属晚期细胞感染阶段的检测根据InlC的，分泌的细菌蛋白，其存储在被感染细胞的细胞质中的荧光标记的单核细胞 ，该测定可耦合到自动化的高通量小分子干扰RNA的屏幕，以便为characterize涉及的向上或向下调节感染的细胞信号途径。

引言

对革兰氏阳性细菌李斯特菌食源性病原体侵入宿主细胞，破坏其内在液泡和复制的宿主细胞1的细胞质。L。菌易于操纵与在细胞和动物模型中观察到细菌毒力性状的持久性相关的实验室环境（快速增长，对健康人低毒性）（溶血活性，白细胞增多）允许在上世纪60年代初期使用作为一个重要的模型研究细胞内寄生，并建立细胞抗感染2免疫力的理论基础。 20世纪80年代末90年代初，细菌细胞内循环3，以及最重要的细菌毒力的分子特性的解剖因素4-7赞成使用L的菌等作为操纵和螺柱的一个关键分子工具Ÿ的宿主细胞的功能。无毒的李斯特菌属的存在（L.英诺克 ）和毒力（ 单增李斯特菌 ）的物种铺平了道路，比较基因组研究8，与最近设立了完整的L.在一起单核细胞转录组9，增加了我们L的进化的理解菌作为一种人类病原体和感染模型系统研究10。

单增李斯特菌在细菌表面的蛋白质INLA和InlB与宿主细胞受体的E-钙粘蛋白和蛋氨酸，分别为11-12之间的相互作用诱导其内化进入宿主细胞。初始候选为基础的研究导致了α/β连环蛋白-肌动蛋白链路的标识作为磷脂酰肌醇3 -激酶（PI3-K）和INLA入侵通路13的作为InlB-关键效应一个显著成分依赖入侵卡斯卡德14-15。蛋白质组学和功能为基础的检测后允许新颖的骨架元素16和所需的宿主细胞侵袭脂质第二信使17的鉴定。转录研究18和质谱为基础的定量蛋白质组学19最近关于棚主信号通路的激活和免疫反应L.在镇压新的光菌感染。系统生物学的方法基础上，大型成套基因（kinomes，完整的基因组）的小干扰RNA失活（RNA干扰）沉默最近已经开始了全球主机在特定的细胞功能，包括细胞吞噬功能的背景下信号通路分析的新途径和病原体内在20。全基因组siRNA筛选此前已进行调查所需的L的感染细胞级联在果蝇吞噬单核细胞增生 S2细胞21-22，但还没有在非吞噬细胞来进行这种类型的分析，这代表体内感染的关键目标。

我们已经进行了优化的协议由L.的显微镜检测感染的晚期阶段这适合于上皮细胞内细菌条目的高通量siRNA的研究菌等 。我们的实验需要一个高度侵袭性L的优势菌菌株呈现在PRFA，L的主要转录调节子的点突变菌毒力因子6：这种突变（名为PRFA *）呈现PRFA组成性激活23，并导致入侵的蛋白质INLA和InlB的表达增加，从而有利于在其他不佳感染非吞噬细胞的细菌进入。我们的读出对于感染是基于分泌性细菌蛋白InlC的的细胞质积累的检测：该分子是一个由胞质内L.优先表达一种多效性效应单核细胞增生 9和其参与不仅在细菌细胞至细胞传播24，但它也调节宿主的免疫反应25。 InlC的分泌的胞内细菌的荧光标记不仅可以明确区分感染与非感染的细胞，也代表一个端点的读出，可用于随后解剖感染在其不同的步骤：输入，空泡逃逸，胞浆菌增殖和细胞 - 细胞间传播。这个显微镜为基础的协议可以被耦合到siRNA筛选因此，研究涉及在宿主细胞中的由L.感染细胞途径菌等 。

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研究方案

1。细胞的制备和细菌培养，转染工具和一抗

  1. 准备一个新鲜的琼脂平板上分离单个L。菌菌落从细菌甘油（50％饱和菌液过夜培养glycerol/50％）保持在-80°C。
    1. 使用铝框（保持在-80℃），以输送在脑心浸液（BHI）琼脂平板冻结的细菌甘油，条纹细菌。
    2. 在48小时（或直到单个细菌菌落可被分离）将培养板在37℃。
    3. 保持这种工作板后，在4℃在1个月（它将被用于接种液体培养物）的最大时间。
    4. 在我们的协议中，我们使用了L。菌血清型1/2A EGDe.PrfA *应变，但如图1所示 ，L。菌血清型4b的P14.PrfA *应变给出了类似的结果。
  2. 他拉ATCC CCL2细胞生长在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中在没有抗生素的补充有10％胎牛血清（FBS）。
  3. 加扰（对照）和抗-Met的siRNA被在黑色384孔显微镜细胞培养板中加载的独立池。
    1. 稀释160皮摩尔的siRNA在500微升不含RNA酶的水中，加入5微升该溶液以每孔（终浓度：1.6皮摩尔）。
    2. 保持这种板在-20℃下1年的最长期限。
  4. 多克隆兔抗InlC的已通过免疫使用InlC的-GST重组蛋白如前面25所描述获得的细菌蛋白。

2。反向的siRNA转染细胞

  1. 感染前72小时，使至室温含有1.6皮摩尔的siRNA在5微升不含RNA酶的水，每孔一个黑色384孔显微镜细胞培养板。
  2. 离心板3分钟，在300相对离心力在室温下，以降低的siRNA可能已经沉积在孔的壁上。
  3. 制备室温下的DMEM补充有0.4％的Lipofectamine RNAiMAX。
  4. 加25微升DMEM / RNAiMAX转染培养基到每个孔中（将其添加到siRNA的前不孵育转染培养基中时间超过20分钟）。
  5. 移动板来回以混合的siRNA与转染溶液，然后保持该板1小时，在室温下，以允许的siRNA-脂质体复合物的形成。
  6. 洗涤HeLa细胞从汇合或亚汇合细胞培养烧瓶一次，用10ml 37℃预热的PBS中。
  7. 分离HeLa细胞中加入1 ml 37℃预热的胰蛋白酶的细胞培养瓶中，孵育3至5分钟，在37℃下
  8. 重悬细胞于10毫升37℃预热的DMEM培养液，16％胎牛血清。
  9. 计数细胞并制备每毫升12000的细胞在DMEM中的细胞悬浮液添加有16％FBS。
  10. 添加50微升的细胞悬液以每孔中的384孔板中。
  11. 快速移动板来回分发细胞，让细胞沉淀下来10分钟，室温下。
  12. 密封该板用封口膜，并保持它为72小时，在湿润的5％CO 2气氛中含有在37℃下

3。细胞感染与染色

  1. 感染前一天，取L的单菌落从BHI琼脂平板上的单核细胞 ，重悬它在5ml液体BHI培养基的15毫升的聚苯乙烯管中。
  2. 孵育过夜，在37℃下在甩歌甩屏设备以允许细菌生长。
  3. 在感染当天，洗将1ml过夜L的通过在台式离心机离心2分钟，10,600 RCF 菌文化。
  4. 弃去上清液（其中包含分泌毒素李斯特菌O），并重新悬浮于1ml的PBS（repea颗粒吨洗涤步骤3次以上）。
  5. 读出的细菌的光密度在600nm处，并估计细菌的数量（OD = 1相当于1E9细菌/ ml）。
  6. 准备充足的L。菌稀释于DMEM补充有1％FBS的：使用高度侵袭性菌株像EGDe.PrfA *，我们建议在30μl的培养基，每孔使用5E4细菌（感染复数被估计为25对2000个细胞）。
  7. 除去各孔中的细胞培养基（80微升），并通过加入30微升的L的更换单核细胞增生含中。
  8. 离心板上于200相对离心力为5分钟，在室温下以同步的感染过程。
  9. 在湿润的5％CO 2气氛中含有在37℃的预热铝块孵育板1小时。
  10. 取出L。单核细胞的含介质从各孔中，加入30微升预热的DMEM补充有10％FBS和40微克/毫升的庆大霉素杀死细胞外L。菌等 。
  11. 孵育在5％CO 2气氛中含有在37℃的预热的金属块上4小时。
  12. 制备PBS中的溶液添加有8％的甲醛（该溶液应新鲜制备，使得甲醛的单体，而不是低聚甲醛的聚合物，被使用）。
  13. 而不丢弃，细胞培养基，加入30微升PBS补充有8％的甲醛（最终浓度：4％），孵育15分钟，在室温下进行。
  14. 除去固定液，用80μl的PBS中，每孔洗涤细胞三次（保持细胞在80微升PBS中，每孔的终体积）。
  15. 准备一个1:250稀释在PBS中的兔抗血清InlC的补充有0.2％皂苷。
  16. 加10μl的第一抗体溶液以每井后除去PBS中孵育30分钟，在室温下进行。
  17. 丢弃的主抗体溶液和洗涤4次，每孔40微升PBS。
  18. 稀释的二抗Alexa Fluor 546 - 偶联的抗兔抗体（1:250），在DAPI溶液（1:1,500）和鬼笔环肽-Dy647（1:150）在PBS中添加了0.2％皂苷。
  19. 加10微升该二次染色溶液的各孔中，孵育30分钟，在室温下进行。
  20. 丢弃二次染色溶液中，用每孔40微升PBS洗4次（留下40微升在每个终体积以及与密封板）。
  21. 该板可以立即进行成像，或者可以被存储在4℃下避光保存（用铝箔覆盖），用于随后的分析。

4。图像采集与分析

  1. 在使用10X物镜安装在自动显微镜（每获得优先以及9张影像）三种不同的通道（350纳米，546纳米和647纳米）获取图像。
  2. 该InlC的信号可以用图像来测量分析软件，如CellProfiler，允许使用的DAPI和鬼笔环肽染色，分别细胞核和细胞体的自动分割。

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结果

细胞质InlC的荧光标记由L.提供了一个强大的读出对细胞的感染菌 ，如示于图1：在显微照片的中心的细胞是高度感染菌株P14.PrfA * 23，因为它可以在相位对比图像（箭头， 图1A）中可以观察到，它是由DAPI信号确认其中个别的细菌可以清楚地分辨（ 图1B）。该InlC的染色（叠加到DAPI染色在图1C）示出了如何分泌蛋白密集堆积在受感染细胞的胞...

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讨论

几个参数是我们InlC的检测协议的成功，包括使用健康细胞系显示一个足够大的胞质，以允许一个明确的检测InlC的信号是至关重要的。在试验中，我们提出本文中，我们提议使用的HeLa细胞的CCL2的，这是特别适合于我们的测定法由于其细胞内空间的延伸中，其他的HeLa克隆诸如海拉京都细胞显示出更小的细胞质中，但可用于与我们的感染协议（京都的HeLa细胞，特别适合于分割的分析，因为细胞不与?...

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披露声明

我们什么都没有透露。

致谢

研究体育科萨特实验室是支持的巴斯德研究所，研究所国家德拉桑特等德拉RECHERCHEMédicale，研究所法国国家农艺，ERC高级格兰特（233348），该法新社国立德拉RECHERCHE（批准MIE- SignRupVac），路易 - Jeantet基金会和基金会乐罗克莱斯Mousquetaires酒店。 AK是从巴斯德 - 巴黎大学国际博士课程/学院卡诺弊端Infectieuses奖学金的获得者。我们感谢杰森 - 美世优化细胞转染协议。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Bacto Brain Heart InfusionBD237500For liquid BHI preparation
Bacto AgarBD214010Supplement to liquid BHI for BHI agar plates
Heat-Inactivated Fetal Bovine SerumBiowest51830-500
DMEMInvitrogen61965-026
Lipofectamine RNAiMaxInvitrogen13778-100
GentamicinSigmaG1397-10ML
Formaldehyde (16%)EMS15710Prepare fresh before each experiment
Anti-Rabbit Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
DAPIInvitrogenD-1306
Phalloidin Dy647Dyomics647-33
siRNA ScrambleDharmaconD-001810-10
siRNA MetDharmaconL-003156-00-0005
Black 384-well microscopy cell culture plateCorning3985
AxioObserver Z1 microscopeZeiss431007 9901
sCMOS cameraAndorNeo
Metamorph analysis softwareMolecular Devices4000
CellProfiler analysis softwareBroad InstitutePublic software available at http://www.cellprofiler.org/

参考文献

  1. Pizarro-Cerdá, J., Kühbacher, A., Cossart, P. Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2, 1-17 (2012).
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Erratum


Formal Correction: Erratum: Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes
Posted by JoVE Editors on 6/25/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes. Three authors were omitted from the article at the time of publication. The acknowledgments section was also updated. The author list has been updated from:

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute, 2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020

to

Andreas Kühbacher1,2,3, Edith Gouin1,2,3, Jason Mercer4, Mario Emmenlauer5, Christoph Dehio5, Pascale Cossart1,2,3, Javier Pizarro-Cerdá1,2,3
1Unité des Interactions Bactéries Cellules, Pasteur Institute,2INSERM U604, 3Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), USC2020, 4Institute of Biochemistry, ETH Zürich 5Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel

The acknowledgments where update from:

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We thank Jason Mercer for optimizing the cellular transfection protocol.

to

Research in P. Cossart laboratory is supported by the Pasteur Institute, the Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, the Institut National de la Recherche Agronomique, ERC Advanced Grant (233348), the Agence Nationale de la Recherche (Grant MIE-SignRupVac), the Louis-Jeantet Foundation and the Fondation Le Roch Les Mousquetaires. A.K. is a recipient of a scholarship from the Pasteur-Paris University International Doctoral Program/Institut Carnot Maladies Infectieuses. We acknowledge support by grant 51RT 0_126008 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology (to C.D.).

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