成像变性的胶原股<em&gt;在体内</em&gt;和<em&gt;体外</em&gt;通过光引发杂交笼胶原蛋白仿生肽

摘要

本程序演示了在附近的胶原重塑活动在小鼠红外荧光成像以及胶原蛋白的使用笼胶原蛋白模拟肽，可以是光引发的杂交与变性的胶原链组织切片的体外活体染色。

摘要

胶原是细胞外基质的支持组织的形成和维护的主要结构成分。虽然胶原重塑正常组织更新的一个组成部分，涉及肿瘤，关节炎和许多其他病理情况下重塑活动过量。在胶原重塑，胶原分子的三重螺旋结构是由在细胞外环境的蛋白酶破坏。此外，目前许多组织的组织样品中胶原蛋白的一部分被固定和保存过程中变性。因此，这些变性的胶原蛋白链可以服务于生物成像的有效指标。我们以前开发一个笼中的胶原蛋白模拟肽（CMP），可以是光引发的形成三重螺旋结构，这是唯一的胶原蛋白杂交与变性的胶原链。这个程序的总体目标是：i）以图像变性的胶原链Ř从正常重塑活性在体内 esulting，和ii）使用的光引发笼中医形象化在离体的组织切片的胶原蛋白。实现有效的杂交和成功的体内和体外成像，荧光标记的笼中医要么被光激活的立即静脉注射前，或在组织切片中，直接激活。在裸鼠体内胶原蛋白和前缀在小鼠角膜组织切片正常的骨骼重塑胶原蛋白进行成像在此过程中。基于所述CMP-胶原杂交技术这里提供的成像方法可能导致组织重塑过程的深入了解，以及允许具有高胶原重塑活性相关的疾病的新诊断的发展。

引言

胶原蛋白，在哺乳动物中最丰富的蛋白，它在组织发育和再生通过支持细胞增殖和细胞分化的关键作用。而胶原纤维（ 如 I型，II），在结缔组织的组织给予的机械强度，网络状的胶原（Ⅳ型）形成基底膜，其中细胞附着并形成有组织的组织基本支架。胶原重塑既包括胶原降解（蛋白酶）和合成（生长因子促进）。虽然胶原重塑，例如在骨，是正常组织更新过程中，多余的重塑活性，或者其在异常发生的地点的一部分，典型地指示伤口愈合响应损伤或慢性的病理状况，如癌症，骨质疏松症，关节炎，和纤维化^1-4。直接图像进行胶原重塑体内的能力，可能导致进度的了解离子这些疾病，以及新的诊断和治疗。例如，实时成像可以提供有关的严重程度和疾病的位置信息，并且还可以用于评估新的治疗剂的疗效。多光子激光扫描显微术和二次谐波的产生已被应用到图像纤维状胶原为在活体小鼠⁵监测胞外基质重塑的肿瘤。然而，这种技术需要的动物将被安装有透明背皮褶腔室，这是一种侵入性程序。胶原重塑的直接和非侵入性的成像将受益于一个探头，专门针对胶原蛋白进行改造。这样的探针很难制备，因为它需要从完整和成熟胶原，其大量存在于正常组织⁶区分的重塑胶原。

胶原是由所谓的三螺旋极其罕见的蛋白结构，这是蛋白酶如在胶原重塑基质金属蛋白酶（MMP）裂解。切割的胶原碎片失去其三重螺旋结构，并成为折叠链（明胶），这是由特异性蛋白酶¹进一步消化。最近发现的胶原蛋白模拟肽（CMP），其具有的倾向折叠成三股螺旋结构，可以专门针对这是从它的三股螺旋状态由任何热变性或通过酶促降解^1,7分离的胶原束。单体中医和变性胶原蛋白链间的结合主要是通过驱动三螺旋杂交。因为中医自我组装成同源三聚体三螺旋在室温下与胶原蛋白杂交，笼子里的小博闻的驱动力[（GPO）的₄ ^注 _{GPO（GPO）4，}指定为_{^{NB（GPO）9，O：}}羟脯氨酸]，被开发，其中包含一个光可切割硝基苄组（NB）连接至肽的中央甘氨酸。毒品调查科笼基立体防止CMP从折叠成三股螺旋，然而，去除网箱组的紫外线照射立即触发的三重螺旋折叠蛋白和胶原蛋白的杂交^1。当标记的近红外（NIR）荧光基团的单体中医是全身性地递送到模型小鼠，它们可以特异性地靶向并允许在变性胶原的组织中进行正常的（ 例如，在骨和软骨）和病理（ 例如，在肿瘤）重塑¹ 体内成像。

荧光标记的中医也可用于在组织学组织切片成像胶原。在组织学研究，收获的组织往往保存了固定，以保持细胞成分，并从整体恶化组织形态。定影的程序，其中包括热，并用有机溶剂处理，以及化学交林肯克的试剂（ 如多聚甲醛），变性胶原⁸的三重螺旋结构。这种变性生成网站为CMP杂交。它已经表明，荧光标记中医可特异性地结合到胶原中固定的组织切片（ 如皮肤，角膜，骨）甚至比抗胶原抗体，这使得轻便鉴定在肝纤维化组织⁹病理状况更有效。在CMP针对含有的三螺旋基序的氨基酸序列，这是共同的所有类型的胶原蛋白的变性的胶原束。因此，中医也算是一种广谱胶原蛋白染色剂。在这里，我们提出了详细的实验程序一）使用成像荧光标记笼中医在体内变性的胶原束和体外组织切片II）可视化胶原。一个近红外标记，IR680，被结合到笼中的CMP实时成像，whilë羧基（CF）用于组织染色工作，其与标准荧光显微镜的兼容性。该协议的重点是中医的成像应用程序相关的胶原重塑。方法为CMP合成可以在以前的报告^1,7,9-15被发现。在这个视频报告，在正常小鼠和小鼠角膜组织切片成像骨骼组织被选择用于示范目的，但这里介绍的方法，可以容易地应用到许多病理和生物模型涉及胶原重构（ 如肿瘤，伤口愈合），如以及几乎任何前缀的组织样本含有胶原蛋白。

研究方案

所有的动物研究得到遵守约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会的规定。

1。附近骨骼胶原重塑体内的红外（NIR）荧光成像

1. 光激活的笼CMP和尾静脉注射
   1. 准备110微升的每个鼠标笼CMP解决方案（20-30克鼠体重）：100微升的配制溶液，用一个额外的10微升缓冲转移和注射过程中可能发生的损失。混合11微升_{^{IR680-AHX-NB（GPO）9}}原液（400μM）与11微升无菌PBS溶液100μM的半胱氨酸;然后使总体积至110微升用1×PBS缓冲液中。最终的肽溶液中含有4纳摩尔_{^{IR680-AHX-NB（GPO），9}}和100微升的1X PBS溶液1纳摩尔半胱氨酸。
   2. 慢慢withdra瓦特肽溶液注入0.5ml的胰岛素注射器用透明桶和一个小计（28-30 G）针，小心地取出气泡。打开紫外灯，让灯预热2-5分钟。
   3. 将含肽的注射器直接在紫外灯（365纳米，> 25毫瓦/厘米^2）5分钟，以允许光激活。
   4. 同时，在一个限制器将鼠标下加热灯，与尾部或其他识别方法，如耳标或脚趾纹身永久性记号笔标记鼠标和消毒尾用70％的酒精。
   5. 紧接在UV活化后，注入100μl的紫外线活化_{^{IR680-AHX-NB（GPO）9}}溶液到尾静脉中，优选在尾部的后部。注射后请将鼠标回到笼子里。
2. 胶原重塑活动的近红外荧光成像
   1. 集用珍珠冲激2.0软件的脉冲成像器至37℃的摄像床的加热板。
   2. 把全裸或鼠标剃成含有氧气2％的异氟醚麻醉诱导室。在处理和通过监测呼吸频率（〜1/sec）核实缺少鼠标移动的麻醉平面的深度。
   3. 鼠标经过麻醉，打开珍珠成像仪抽屉，然后将动物的成像床上。快速去除鼻锥塞，并滑动鼠标的枪口鼻锥内的成像过程中，以保持鼠标在麻醉状态下（在氧气2％异氟烷在2升/分钟通过鼻锥交付）。一旦鼠标到位，关上抽屉。
   4. 当仪器显示“准备就绪”的图像软件面板上，点击“700路”，“白光”和“85微米”框后面的“获取图像”按钮。近红外光谱（激发685 nm，发射720纳米）的D白色光照片，然后将使用自动对焦和曝光拍摄。
   5. 当录制完成后，打开抽屉，打开鼠标，并从另一个角度获取图像。鼠标可以放在它的前面（腹），背（背）或朝向相机两侧。磁带窄条可以作为约束伸展四肢得到的利益（ 如肋骨，脚踝和手腕）该地区的最佳观赏。
   6. 一个适当的时间来观察IR680-CMP的骨骼摄取24-96小时后注射（HPI）之间，根据用量（〜4纳摩尔/鼠标）。为了获得高分辨率的图像，牺牲鼠标颈椎脱位而根据深麻醉后72 HPI，用手术钳和剪刀去除皮肤（和头发），和上述图像是由近红外荧光。
   7. 分析获取的近红外荧光图像。

2。胶原蛋白的前体可视化0;组织切片

1. 材料准备
   1. 制备将1ml 10％（重量/体积）在去离子水中的BSA溶液。解冻1毫升山羊血清在水浴中在室温下进行。切几片封口膜在大约2厘米×5厘米大小。
   2. 准备10毫升封闭缓冲液通过混合500μl的山羊血清，1毫升的10倍的PBS和8​​.5毫升去离子水。通过稀释50微升10％（重量/体积）牛血清白蛋白4.45毫升去离子水和500微升10X PBS制备5毫升CMP稀释缓冲液。
   3. 稀释储备液的羧基标记笼的CMP，CF _{^{NB（GPO）9（480}}微米），以使用CMP稀释液5微米。从2.5-30μM的最佳CMP浓度而变化，这取决于组织的类型和组织样品的性质。 100微升卷被推​​荐用于染色的一个组织部分幻灯片。存储制定的CM​​P SOLUT离子在黑暗中。
   4. 让小鼠角膜组织切片平衡至室温。孵育载玻片在1×PBS缓冲液中5分钟。在此演示中使用的小鼠角膜组织中均带有前缀在PBS溶液中的4％多聚甲醛固定1小时，冷冻保存在Tissue-Tek的十月介质，cryosectioned至8微米的厚度，以及安装在带电载玻片上。
2. 组织染色和成像
   1. 将玻片在湿盒。每个滑动，申请0.5毫升阻断溶液并孵育载玻片30分钟，在室温下进行。通过印迹在纸巾上的幻灯片除去封闭液。
   2. 动用约100微升的CF _{^NB（GPO）9}解决方案，以覆盖每个幻灯片的组织切片。孵育载玻片，持续2分钟，以允许在CMP溶液渗透到组织中。
   3. 打开紫外灯。当灯泡预热，露出CMP覆盖的组织本身ctions紫外灯为6分钟（365纳米〜8毫瓦/厘米^2）脱保护笼中医。紫外线照射后，覆盖每个滑动用一块封口膜，以防止干燥的组织切片。将载玻片在潮湿的腔室，并培育它们在4℃下2小时。
   4. 准备1:3,000稀释在1x PBS DAPI的解决方案。 CMP染色后，轻轻地用钳子取出封口膜，涂抹在纸巾上的幻灯片，以去除多余的CMP解决方案。适用于约100μl的稀释的DAPI溶液到每个组织切片后，于室温下放置1分钟。
   5. 染色后，浸泡在1×PBS缓冲液中的幻灯片染色缸5分钟。重复此3X新鲜PBS洗涤，洗去未结合的染色剂。
   6. 加安装介质上的组织切片的降低，且用玻璃盖玻片覆盖它，同时避免俘获气泡。放幻灯片在一个纸板滑动托盘，以保护他们免受光。
   7. 图像中的胶原纤维束（FITC通道）和细胞核（DAPI通道）中使用荧光显微镜的组织切片。

结果

图1示出的24-96小时后喷射后的光引发_{IR680-AHX-（GPO）9}如何分布在一个健康的雌性SKH1裸鼠的典型结果。它显示了明显的CMP堆积在骨架后24 HPI，在该点最未结合的肽的已在很大程度上被清除出去。 CMP与重塑胶原链杂交的过程似乎相对较慢，尤其是在与其他肽成像探针（ 如 RGD ^16）。这最有可能是因为胶原蛋白的三螺旋^17,18的慢折叠率。然而，一旦杂交，在CMP链强烈结合于胶原的组织，由于只有轻微的信号还原后24 HPI（ 图1）所示。在96 HPI，皮肤切除后鼠标的近红外荧光图像清楚地表明IR680-AHX-（GPO）的骨骼摄取₉在脊柱和肋骨，以及内部的膝盖，脚踝，手腕和下颌骨（ 图2A）。

在离体组织染色，光引发荧光标记的笼中医特异性杂交的组织切片中变性的胶原束。在图3中，CMP染色清楚地表明在角膜基质，这表明其作为一个具体的胶原蛋白染色剂使用的细平行的胶原纤维。

图1裸鼠的串行近红外荧光图像静脉给药与照片decaged _{IR680-AHX-（GPO）9}显示了为期四天的骨骼吸收。 点击这里查看大图。

图2。给予照片decaged IR680-AHX-（GPO）的小鼠近红外荧光图像_{如图9（A），}笼^{_{IR680-AHX-NB（GPO）9}}无紫外线照射（B），预先折叠的三螺旋[IR680-AHX-（GPO _{）9] 3（C）}或热分解单链_{IR680-AHX-（GPO）9（D）}在皮肤去除后96 HPI。骨靶向通过CMP只能在A和D可以观察到。近红外荧光信号都显示在彩虹的规模。 点击这里查看大图。

图3。鼠标共同荧光显微rneal组织切片前缀在多聚甲醛固定，并用DAPI染色和光引发_CF（GPO）9使用协议2，显示致密的胶原基质（通过CMP染色，绿色）以及细胞上皮和内皮（通过DAPI染色，在蓝色）（比例尺：100微米）。

讨论

如可在此协议中可以看出，CMP的递送是直截了当的，因为紫外活化的笼中医是唯一的额外步骤，以共同的尾静脉注射协议^19。关键是要注入肽探针的出笼和亚稳单链状态。轿厢组防止CMP从自组装体和结合到胶原蛋白（ 图2B），直到它被UV光在该点进行CMP开始折叠成三股螺旋除去。注射制剂含有半胱氨酸，它可以与开裂笼组紫外线照射期间迅速作出反应，以减少毒性。众多的小鼠不同品系（ 如 SKH-1和DR-1），使用这一提法已经过测试，而且我们没有发现这些小鼠的任何行为或其他健康缺陷长达六个月。如果注射不暴露于紫外线后立即跟进，中医师会折叠成三聚体的三螺旋，它们没有什么可杂交能力图2C显示了一个极端的情况下注射前的中医已全部重新组合成三螺旋通过长时间的延迟时间（> 2天）。为了解决这个问题，CMP溶液应在相对 ​​低的浓度（ 例如 〜40微米）来制备，和UV-decaging后立即注射到小鼠中。由于慢三螺旋折叠率稀释条件的中医（半时间的复性：> 50分）和短紫外线照射和注射时间（5〜7分钟计），大部分的中医单进入血液钢绞线表格时，此协议遵循。一旦注入，中医有望保持为单链，随着浓度由20倍的血池减少，从而导致显着减少的重组率^18。如果注射被延迟（ 例如 ，由于动物处理）和同源三聚体重折叠被怀疑的部分组装肽可通过加热被重新激活，以高于7076，C解离的中医师为单链，然后迅速冷却和喷射。虽然不太方便，例如热解离中医还将显示预期的体内靶向（ 图2D）的结果。

在这个演示中，裸鼠被用于近红外荧光成像，因为近红外信号的高达50％，可阻止头发。当与头发的小鼠模型（尤其是那些与黑毛）的工作，我们建议使用电动剃须刀或头发卸妆妆鼠标在成像之前感兴趣的区域。在图1中，有从该动物的腹部区域，这是由自体荧光叶绿素在动物饮食引起的假阳性信号。这样的背景信号可通过切换鼠标纯化日粮成像之前约4天显著降低。如可见于图1和图2A所示 ，有强烈的CMP摄取在尾旋Ë。因此，为了避免从不完善尾静脉注射造成伪影，我们建议在尾部的后部注入，使得在注射部位未在荧光图像捕获。

标记CMP使目标的胶原重塑体内 ，很难用其他方法来检测特定位置和成像。例如，在基于ELISA的血液和尿液测定法可用于切割的胶原端肽片段的敏感，但该方法不能定位的胶原周转的来源，因为它针对可溶性抗原。使用近红外光谱的体内成像技术的主要局限性标记中医是深度的穿透衰减和淬灭基汇集红细胞血红蛋白是七百一分之六百八十〇纳米的近红外染料的内源淬灭剂。 CMP的体内成像的未来应用包括使用中医标记直接发射γ射线的放射性核素或正电子EMI SPECT或PET成像tters，用于诊断涉及胶原重构（ 例如，骨质疏松症，关节炎，动脉粥样硬化和纤维化）的疾病状态。这些放射性标记的CMP类似物将消除由于组织的深度和汇集红细胞的存在信号损耗的限制，并允许患病组织的定量测量。此外，比较晚成像时间（ 例如 48-96 HPI）从中医的慢绑定和清拆行动而可能使其难以按照胶原重塑的快速变化。这种限制可以通过结合动力学和CMP显像剂的亲和力进一步的工程来克服。由于CMP结合具有小结构变性胶原中，基于CMP的胶原蛋白成像是相辅相成的二次谐波产生显微镜只能像胶原纤维^5。

当染色组织切片与荧光标记的中医师，我们发现它有利于孵育中在4℃下，在UV活化的肽溶液样品，因为三重螺旋杂交变得容易在较低温度下^1,20。它也被发现，浸渍在染色缸中新鲜的PBS缓冲液的幻灯片是，洗掉未结合中医，其中工程不是仅仅在样品移液洗涤缓冲液好得多的最有效方法。在CMP-胶原链的杂交，是非常具体和鲁棒的，因此在这个视频呈现的简单染色方案可以容易地修改为costaining额外的生物标记物，以及用于识别在未固定的组织切片的胶原降解。这是一个有效和方便的替代品使用抗胶原抗体检测胶原纤维组织的各种样品中。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRdye 680RD Maleimide (IR680)	LI-COR	929-71050	Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1.
5(6)-Carboxyfluorescein	Sigma	21877-5G-F	Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12.
Cysteine	Advanced Chemtech	YC2200
Isoflurane	Butler Veterinary Supply	4/4/5260
Goat Serum	Sigma	G9023-10ML
Albumin from bovine serum (BSA)	Sigma	A9647
DAPI	Roche Applied Science	10236276001
Fluoroshield mounting medium	Sigma	F6182-20ML
Syringes	BD	329461
UV lamp	McMaster-Carr	1447T17
Pearl impulse imager	LI-COR	9400
Surgical forceps and scissors
EasyDip slide staining system	Light Labs	M900-12B
20-place cardboard microscope slide tray	Light Labs
Cover glasses	Fisher	12-545-c
Fluorescence Microscope	Nikon	Eclipse TE2000-E