新的细胞内病原体由Amoebal共培养和Amoebal富集途径探索

摘要

Amoebal共存是使用贴壁变形虫以选择性地生长细胞内的病原体能够抵抗吞噬细胞如变形虫和巨噬细胞的细胞培养系统。因此，它代表发现新的传染性病原体的关键工具。 Amoebal富集允许发现其特定的细胞内细菌的新amoebal品种和。

摘要

细胞内病原体如军团菌，分枝杆菌和衣原体样生物是难以分离，因为它们往往较差或根本不生长在所有上，通常是用于培养细菌的选择性培养基。由于这个原因，许多这些病原体被发现仅在最近或以下重要的爆发。这些病原体往往与变形虫，它作为宿主细胞，并允许细菌的存活和生长有关。我们打​​算在这里提供了两种技术，使孤立的细胞内病原体和表征目前临床或环境样品中的示范：在amoebal共培养和amoebal富集。 Amoebal共培养使细胞内细菌的恢复由所研究的样品接种到一个amoebal草坪，可感染并裂解由存在于样品中的胞内细菌。 Amoebal富集使得目前临床或环境样品中变形虫的恢复。钍是可能导致发现新的amoebal物种，但也是新的细胞内细菌在这些变形虫专门生长。总之，这两个技术有助于发现能够在变形虫长出新的细胞内细菌。因为他们的感染变形虫和抵制吞噬能力，​​这些细胞内的细菌也可能会被巨噬细胞吞噬逃脱，因此，是致病性高等真核生物。

引言

分子诊断来临之前，目前在环境壁龛或临床样品中的微生物经培养他们在不同的选择性培养基，主要是在琼脂培养皿中经常发现。细菌菌落和其代谢活性的表现型，让细菌分类在物种水平。肉汤也可以被用于增加检测的灵敏度。然而，这两种技术不允许该生长缓慢或根本没有在这些介质上的细菌的恢复。这就是为什么分子生物学方法被如此广泛地采用了时下的原因。然而，检测DNA提供了对细菌的生存能力没有线索。另外，相反地，以培养，分子生物学方法不会导致菌株，可以进一步表征。

研究病原体生长不良固体培养基上，或需要细胞生长是复杂的。大多数这些“难以生长”的细菌都讲究不及物动词脱细胞的细菌，经常发现其特征如下，因为它是为嗜肺军团菌的情况下大规模爆发。这种细菌的特点如下，一位美国退伍军人大会期间发生的爆发。多达182人被感染，29死于严重肺炎^1,2。后来证明，变形虫是这种细菌的自然宿主，而他们在酒店空调系统和供水网络的存在是在所谓的退伍军人症³爆发的起源。

变形虫是目前全球范围内的土壤，空气，水和人类志愿者^（4审查）的鼻腔粘膜分离。这些“自由生活”变形虫一般都划分在自主的环境，但有时可能会侵入许可主机^5。通过吞噬作用和随后的溶酶体消化HY上的各种微生物饲料阿米巴drolases ^6。许多兼性或专性细胞内细菌能够抵抗消化，从而感染和阿米巴划分为例如军团菌 ， 衣原体相关的细菌或分枝杆菌^（7审阅和^8）。自由生活的阿米巴可能是一个重要的潜在水库已尚未被发现的细胞内细菌。这导致本集团在洛桑实现两个主要的技术，称为amoebal共培养和amoebal富集，这使得不同的群体从不同环境样品^9-15隔离了几个新的专性细胞内微生物。

由于变形虫是专业放牧吞噬细胞对细菌，能抵抗吞噬和这些原生生物生长里面的细菌也可能拓殖人的吞噬细胞和致病走向人类。这是部分地显示出对某些衣原体相关的细菌，如Waddlia町ndrophila。 W. chondrophila不仅可以在变形虫而且在一些细胞类型中，如哺乳动物上皮细胞，巨噬细胞，和鱼细胞系^16-18成长。该amoebal共培养也出现相关检测细胞内细菌的临床标本^19,20，包括大便这是严重污染，不同的细菌种类^21。

在这里，我们描述amoebal共培养和amoebal富集的主要步骤，包括：（一）治疗环境或临床标本;变形虫（二）在无菌介质中生长，对大肠杆菌的细菌草坪及（c）选择和表征胞内细菌。

研究方案

1。 Amoebal共培养

1.1样品制备

1. 环境样品
   1. 水样
      通过0.22μm孔径的膜过滤水样（500毫升至1升）。然后，摇动膜在页面的阿米巴盐水介质首席助理秘书长（120毫克氯化钠，4毫克硫酸镁_{4•7H 2 O，4}毫克氯化钙_{2•2H 2 O，142}毫克的Na ₂ HPO _4，和136毫克的KH ₂ PO ₄在1升的蒸馏水）。
   2. 固体样品
      悬浮固体样品像土壤或沙子样品和半固体样品，如活性污泥在蒸馏水或PBS中，通过0.22μm孔径的膜过滤。然后，在摇PAS膜。
   3. 样品严重污染的内生阿米巴原虫和
      首先通过低速离心（180×g离心）FO沉淀样品-R 10分钟或通过5微米孔径的膜过滤。进一步处理上清液（分别滤液），如在1.1.1。
      注：其他净化技术可以用于进一步净化环境样品：将样品加热，在50℃下进行30分钟或治疗用酸性或碱性溶液^14。
2. 临床样本
   处理临床样品根据它们的物理 - 化学性质。过滤或离心液去除大杂质。悬浮固体样品。使用的组织，通过用Dounce homogeneiser或玻璃珠研磨它们，例如，和裂解细胞以释放细胞内的细菌。

1.2变形虫准备

1. 肉汤准备
   准备以下介质：含蛋白胨，酵母提取物和葡萄糖（PYG富媒体;100克胨，10克酵母提取物4.9克MgSO ₄干燥•7H ₂的输出，5克柠檬酸钠•2H _{2 O，0.1g}的铁（NH _{4）2（SO 4）2•6H 2 O，1.7}克KH ₂ PO _4，1.97克Na ₂ HPO ₄的•7H _{2 O} 45克 ​​葡萄糖，和0.295克的CaCl ₂在5升蒸馏水）和非营养性介质，如PAS为棘阿米巴物种。
2. Amoebal文化
   1. 在装有30ml PYG培养基的细胞培养瓶中培养变形虫（优先氏棘阿米巴 ATCC 30010或A多食领潮-AP1）在25°C。
   2. 由烧瓶中剧烈摇晃收获变形虫和离心细胞悬液10分钟，1,500×g的。与PAS中等两次洗涤沉淀。计数细胞在KOVA幻灯片，调整音量，以获得每毫升5×10 ⁵细胞悬浮液。
   3. 转移amoebal悬挂到微孔板。使用每孔1毫升12 - 和24-W埃尔板，500μl的48孔板中，并加入300微升96孔板中。孵育微孔板至少2小时，在25℃下这允许沉积和附着在变形虫的每个孔的底部。

1.3共培养

1. 样品接种
   1. 从2.3.3接种板与试样的从1.1或1.2系列稀释液，通常以10倍稀释系列，从用100μl稀释的样品。
   2. 离心微孔板在1800×g离心10分钟，沉淀在amoebal草坪上的微生物可能存在于样品中。这增加了接触和微生物的吞噬变形虫。
   3. 孵育板45分钟，在25℃下并且通过与新鲜的PAS更换介质洗涤三次，PAS。添加每孔1毫升PAS添加或不添加抗生素（链霉素，青霉素，庆大霉素和/或万古霉素）的，取决于bacteri被搜索的人的物种。
   4. 孵育微孔板在32℃，饱和湿度条件下，以避免阿米巴的包囊。每天用20倍物镜观察每孔检测细菌入侵和裂解变形虫的存在。
   5. 在溶解的情况下，通过接种100μl的共培养物中，以约10 ⁵变形虫/ cm ²的单分子层上执行新鲜变形虫一个传代培养。要明确地隔离特定的细菌种类，接种设计也为这些细菌（ 即 BCYE琼脂军团菌 ）的具体琼脂培养基。
   6. 在没有溶解，取100微升共同培养的初次接种后4至7天，接种900微升新鲜amoebal文化在24孔板。如果不带细菌的增殖观察变形虫的快速裂解，病毒可能存在。在这种情况下，过滤上清液在0.22微米和使用该过滤悬浮液感染新鲜的变形虫。

   1.4细菌分离和鉴定

   1. 细菌染色
      直接在24孔微孔板上执行的玻璃盖玻片上共培养物。取出介质，并进行染色或免疫荧光。
      1. 修改Romanowsky染色
         1. 让盖玻片干。浸入盖玻片在固定液（2毫克/升坚牢绿在甲醇中）5次。
         2. 沉浸在盖玻片五次染色溶液I（1.22 g / L的曙红的G磷酸盐缓冲液pH值6.6）
         3. 最后，将其浸入盖玻片5倍，在染色溶液II（在磷酸盐缓冲液pH 6.61.1克/ L噻嗪）。
         4. 冲洗样品用蒸馏水冲洗。让干燥并通过显微镜观察。
      2. 抗酸染色
         1. 让盖玻片干。盖上施乐品红样品。加热染料具有阻燃，直到蒸气出现。
         2. 在室温下冷却至少5分钟并用蒸馏水冲洗。覆盖所述样品与在异丙醇中进行2分钟的3％盐酸溶液，并用蒸馏水冲洗。
         3. 覆盖30秒用亚甲蓝和用蒸馏水冲洗。让干燥并通过显微镜观察^22。
      3. 希门尼斯染色
         1. 通过将100毫升10％碱性品红（10克碱性品红在100毫升95％的乙醇），加入250毫升4％的含水苯酚和650毫升蒸馏水中制备碱性品红贮备液。在37℃，使用前48小时。
         2. 让盖玻片干燥和修复通过火焰传递给它。盖在2分钟新鲜过滤的碱性品红（4毫升碱性品红储备液在10毫升的M 0.1的磷酸钠缓冲液，pH 7.45）的样品。
         3. 冲洗样品与水和10秒的孵育中孔雀绿（在蒸馏水中的0.8％）。用清水再次冲洗和重复孔雀石绿染色。用清水再次冲洗。让盖玻片干，M'mount它，并通过显微镜观察^23。
      4. 免疫荧光
         1. 孵化甲醇5分钟，或用多聚甲醛10分钟4％固定盖玻片。
         2. 用PBS洗涤三次，并用封闭液（5％BSA，0.1％皂苷的PBS中）在室温下孵育2小时。
         3. 孵育盖玻片1小时阻断含有提出对感兴趣的微生物的抗体溶液。
         4. 在PBS中再次洗涤三次，并孵育1小时用针对第一抗体和连接到荧光团的第二抗体。用PBS洗三次，安装盖玻片，用荧光显微镜观察。
   2. DNA的PCR检测
      从100到200微升amoebal共存的提取DNA。检测微生物与靶向16S rRNA基因或特异性引物对感兴趣的物种，如分枝杆菌²⁴通用引物，军团菌²⁵或Chlamydiales ²⁶的成员。

   2。 Amoebal富集

   2.1。样品制备

   通过涡旋重新悬浮固体和半固体样品中PAS。离心悬浮液以低速（180×g离心）10分钟。这允许在小球自由生活阿米巴富集。上清液可用于amoebal共存，沉淀为amoebal富集^21。

   2.2。培养基的配制

   1. 加入1.5克琼脂的至100ml的PAS和高压灭菌该培养基15分钟，在121℃下倒入温暖的介质在培养皿中，让在室温下固化。
   2. 在LB或巯基乙酸盐肉汤生长的大肠杆菌 （ATCC 25922）中过夜，在37℃下用PBS洗两次的细菌和悬浮在其中的PAS媒体。稀释10倍的PAS和传播2-3毫升这种稀释对的PAS琼脂平板上，并让其干燥。

   2.3。样品接种

   加一滴样品（或一块滤波器）在板的一侧，并且让它流过培养皿中，形成在盘的中心的直线。

   2.4。 Amoebal增长和amoebal亚文化

   1. 每天观察培养皿中。如果amoebal迁移前被检测到，切出一小块琼脂在迁移前和接种新鲜NNA培养皿盖上E的草坪大肠杆菌 。
   2. 重复该回接几次取决于样品的纯度，以便具有给定的amoebal菌株的纯培养物。

   2.5。变形虫和细菌鉴定

   1. 刮细胞，重悬在他们的PAS。
   2. 提取DNA并确定变形虫和/或细菌共生菌通过PCR和测序（16S rRNA基因的扩增对细菌，呼吸道。18S rRNA基因的变形虫和测序，例如）的身份。
   <李>使用在这些PAS刮下细胞接种到新鲜变形虫和执行amoebal共培养，以检测可能存在于样品中的细菌。

结果

使用amoebal共培养和amoebal富集，环境和/或致病菌的整个范围被发现（ 表1）。

Amoebal共培养采​​用由本集团及其他分析环境样品，水处理厂和配水系统。范围广泛的微生物可能是孤立使用这种技术。分离amoebal共培养中最常见的细菌是分枝杆菌属的成员，可以从污水处理厂，并从水网^{13,14,24,27,28}回收。 军团菌和α-变形细菌物种也可从污水处?...

讨论

Amoebal共培养和amoebal富集是使许多新的细菌和amoebal物种的隔离有效的方法。用这些方法得到的结果证实了这两种阿米巴变形虫和抗细菌在环境中无处不在，最有趣的是在被认为通过化学处理，如氯化，臭氧控制人为供水网络。 Amoebal共培养和amoebal富集是必不可少的工具来隔离和培养这些潜在的病原微生物，并获得菌株纯培养，才能再进一步研究其生物学和致病性。最近，这种方法被改编为巨病毒...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glucose monohydrate	Merck, Darmstadt, Germany	108342
0.22 μm pore size membrane	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	SCVPU11RE
proteose peptone	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	211693
yeast extract	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	212750
Cell culture flasks	Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ	353135
Kova slide	Hycor, Indianapolis, IN	87144
cell culture microplates	Corning Inc, Corning, NY	3524
Diff-Quik staining kit	Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany	130832
Ziehl fuchsin	Fluka, St-Louis, MI	21820
basic fuchsin	Sigma, St-Louis, MI	857843
Phenol	Sigma, St-Louis, MI	P1037	Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate	Fluka, St-Louis, MI	63160
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA	15710
Saponin	Sigma, St-Louis, MI	84510