长鼻扩展响应协议为侦查行为可塑性的昆虫：应用基础，生物医学和农业研究

摘要

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

摘要

昆虫修改他们的反应与生存（ 如食物，配偶，威胁）重要事件相关联的刺激体验刺激通过。还有，通过该昆虫学会凸协会和它们涉及这些事件的几个行为机制。重要的是要理解这个行为可塑性的，旨在帮助对昆虫有利于农业的程序是很重要的。这种理解，也可用于发现解决由昆虫作为传病媒介和害虫创建生物医学和农业问题。长鼻扩展响应（PER）的调理方案，开发了蜜蜂（ 蜜蜂 ）在50年前，研究他们是如何看待和了解花香气味，而信号的花蜜和花粉资源的殖民地需要生存。在每次操作提供了一个强大和易于运用框架学习几种不同的生态有关机甲行为可塑性的共享机制。它是为使用容易适应与其他几种昆虫物种和其他行为的反射。这些协议可以很容易地用在各种装置，用于通过电生理或生物成像监测神经活性在中枢神经系统一起使用，或者用于操纵靶向神经调节途径。它是一个强大的检测快速检测造成的环境压力，毒素或农药的行为亚致死效应。

我们将展示如何在每个协议是简单的实现使用两个程序。一种适合作为实验室练习为学生或对实验性治疗的效果的快速检测。另一个提供更彻底的控制变量，它是行为调节的研究很重要。我们显示如何若干措施的行为反应，从二进制是/否到像延迟和长鼻延伸的持续时间更连续变量可以用来测试hypothese第而且，我们讨论了一些陷阱，当他们使用的程序的第一次，研究人员经常遇到的问题。

引言

许多昆虫了解生态相关的刺激，然后他们改变他们的行为反应的那些刺激，以适应其环境中的新的预测关系。几种不同的机制可以这背后行为可塑性（ 例如 ，非关联，关联/巴甫洛夫和操作性/器乐^1）。这些类型的可塑性的不同之处是如何刺激或行为都与重要事件，如食品的出现，伴侣，或危险有关。理解这些形式的可塑性是用于基础研究非常重要成神经系统如何变化来编码新的记忆^2。这也是理解昆虫是疾病的重要媒介（ 如 ，采采蝇和蚊子）和昆虫是农业上重要的适应性行为重要的是，无论是在作物生产（蜜蜂）或害虫。

学习行为可塑性任何阿尼姆人需要实验控制的电平超过了一些变量是不能达到的，在字段^1。它要求能更加控制的条件下被使用，但它仍然是相关与在自然条件下的行为健壮调理协议的发展。蜜蜂（ 蜜蜂 ）是如何开发的协议，用于执行行为可塑性^3,4对照分析一个很好的典范。长鼻扩展响应（PER）的蜜蜂是一种自然的行为反射在蜜蜂扩展其长鼻回应触角刺激糖溶液。在正常的觅食行为，每当蜜蜂发现蜜源的花出现。幸运的是，蜜蜂很容易表现在实验室这个简单而容易量化的行为。这使得有可能研究，在受控制的环境，影响这种生态相关的行为⁵的机制。每CAÑ ​​还可以调理协议中用于研究不同的处理条件，其目的是为了揭示背后的可塑性⁶的行为和神经机制的刺激下，知觉，学习与记忆。

由于由桑原⁷所述第一研究中，每调理已广泛用于揭示非结合，缔合和背后行为可塑性在蜜蜂⁸操作性的机制。这些机制中的那些相同的自由飞行蜜蜂⁹的研究显示。不同于自由飞翔蜜蜂的研究，每调理协议可以与电^10,11或脑活细胞荧光成像^12-14。此外，PER协议允许经由药物或分子遗传学的治疗实验操作的神经通路的测试有关网络的特定组件，例如neur的作用假说omodulators ^15,16。市盈率协议也提供了评估的环境条件，以及对健康的毒素和蜜蜂¹⁷的觅食效率的亚致死效应的重要途径。

此过程说明了两个并行的气味传递方法。方法1是一个版本的气味和非条件刺激（蔗糖）交付，提供了一个价格低廉，技术简单的方法呈现的气味和蔗糖的奖励。这种方法是很好的基础训练，当自动化是不可能的。这是介绍这种技术到教室或教学实验室的极佳方式。在调理涉及更困难的任务和气味的感知，学习，或存储器的耦合生理评估实验，这是非常重要的，以精确地和精确地调节刺激的发作，持续时间递送定时。对于最可靠的刺激传递，使用自动化的气味交付的手段ND奖励交货的精确方法。方法2采用自动化的气味传递和更精确的蔗糖交付。它在技术上是更复杂的，并且需要更多的初始设置比方法1，但它显著增加用于调节刺激的定时和数量的一致性，应尽可能使用。

研究方案

1，气味（条件刺激）墨盒安装

1. 在实验中，设置多个气味盒所有需要的调节试验的不同气味的开始。
   1. 使用通风柜的气味稀释和气味盒准备。从未公开的瓶子通风柜以外的气味，由于气味将整个实验室迅速扩散和潜在的调节之前暴露的蜜蜂的气味。此外，戴手套而设立的气味和墨盒彻底清洗之后，以避免造成蜜蜂对气味在处理它们。
   2. 确保每个气味盒标明了它第一次使用气味的彩色编码标签。从未超过一个气味使用气味盒（注射器筒或柱塞），因为可能会出现卡盒上的残余气味。
2. 准备异味和气味的混合物
   1. 稀释在任己烷或矿物油的气味对desired浓度。
      注：改变气味的浓度或呈现两种或更多种的加臭剂的混合物可允许的附加方面调查如何蜜蜂感知的气味和学习的条件相关联。气味混合物可以很简单，比如50:50的二元混合物或复杂如一些气味，模仿自然的嗅觉刺激。减少气味的浓度也增加了工作的难度。
      1. 气味会变得枯竭与重用的墨盒（ 图2）。为了避免损耗的问题作出足够的墨盒，能够切换到一个新的墨盒每次10-12用途。
3. 准备气味墨盒
   1. 方法1
      1. 对于这种方法，使用20个毫升的塑料注射器用的滤纸15毫米直径的圆钉扎到柱塞的气味墨盒的橡胶末端。
      2. 从注射器取出活塞，用图钉来连接件滤清器的ř纸到冲头的端部。
      3. 用微量放置10微升的气味到滤纸上，然后重新插入柱塞入注射器筒。推动柱塞，以15 ml刻度上的注射器管。
   2. 方法2
      1. 对于这种方法，使用1毫升的玻璃或塑料的结核菌素注射器（或类似的体积和形状的改性移液器）与滤纸条内部和橡胶或硅酮限制器在注射器管的气味墨盒的宽端。
      2. 取出从1毫升的结核菌素注射器筒的柱塞。注射器管将是气味盒的主体。
      3. 除去从针筒柱塞的黑色橡胶塞尖和切断的橡胶末端的封闭端。
         注：此橡胶圈将作为一个限制器，以减少吸入的气流在赛场上，这将过早地画出来的气味盒及以上的内敛蜜蜂。另外，硅胶管（4.8毫米欧特ř直径）切成5毫米部分工作为限。
   3. 冲洗注射器筒和橡胶/硅限制器，用70％乙醇的内侧（以除去多从以前使用的剩余气味的），并让它们风干。
   4. 放置滤纸0.2×4厘米的条插入筒的宽开口，从而在纸张延伸1-2厘米以外的开口。
   5. 使用微量吸移放置3-10微升的气味到滤纸而不让气味触摸注射器管的端部。枪头可重复使用相同的气味，但一定要使用新鲜的提示来设置下一个气味。
   6. 打开注射器管的宽开口向上，以便在滤纸滑动迅速进入管。插入节流到注射器筒的宽开口。
      1. 确保每个气味盒标明它首先用于气味的彩色编码标签。切勿使用气味盒（注射器管或restrictor）为一个以上的气味，因为可能会出现在其上残留的气味。
   7. 球一个不掉毛组织的结尾，用70％乙醇浸泡，并用它来彻底擦拭墨盒的外表面，以除去残留的气味在盒的外面。

2，收集，限制和饲养的蜜蜂

1. 准备蜂抑制线束
   1. 进行简单的限制安全带的蜜蜂出塑料饮料吸管，硬质塑料管，或加工金属管（均为约0.9厘米内径，并有1-2毫米壁厚）。采用坚固的吊带涉及外科手术。
   2. 切管为3厘米的段。然后，部分地修剪掉大约一半的上1厘米线束的，使其更容易保持蜂到位而紧固的线束。
   3. 切胶带的0.2×6cm的条状，将其一端连接到蜂具，LEA的一面VING，另一端自由。
2. 收集工人蜜蜂
   1. 从入口到殖民地收集的工人，因为他们从殖民地出发前，暂停或因为他们从觅食回来。
      注：将一块金属丝网，用孔足够大的工蜂爬行通过，在入口处放慢返回工人下来，使得它更容易捕捉到他们，他们进入殖民地之前。
   2. 将闪烁瓶中过蜜蜂，直到它飞了进去。保持其开放水平或朝下，而盖固定小瓶让蜜蜂飞不起来了小瓶的。将只在每个小瓶蜂。确保盖子上有个孔，以便有足够的气体交换。
   3. 收集蜜蜂迅速，尽量减少他们在瓶中花的时间。请在树荫下的小盒子，在这些蜜蜂的小瓶。
   4. 传输盒与瓶和蜜蜂的实验，并把小瓶入冰水SL厄里直到蜜蜂停止移动。一旦蜜蜂是不动的，从冰立刻取出小瓶，以避免过度暴露于寒冷，把蜜蜂变成限制安全带。
      注意：我们不建议把蜜蜂在冰箱或冰柜，因为它是难以监控的时候，蜜蜂变得不动，导致过度暴露于寒冷。当利用10多蜜蜂，转让只有少数蜜蜂冰 - 水浆的时间。
3. 抑制蜜蜂
   1. 放置蜂在其背侧胸部朝向管道的切去部分和它的头部只是管子的顶部上面的线束。轻轻按压蜂靠近油管所以其口器延伸超过管子的边缘。滑动管道胶带的条带在头上的蜂的背侧胸部之间并牢固的自由端连接到线束的侧面。
      1. 确保对线束胶带光滑紧绷。不应该有任何的NotI蜂线束的前部和磁带，磁带之间ceable间隙应平躺在配线的顶端。如果有空白的蜂可能无法正确​​地延长其长鼻或者它可以逸出。此外，请确保蜜蜂的前腿没有线束的正面和胶带之间突出。
4. 饲养蜜蜂的饲养，以调节区间
   1. 约30分钟以下治理 - 后蜜蜂已经从初始设置回收 - 喂蜜蜂3-4微升0.5M的蔗糖（在水中）。这笔款项将足以满足3-4小时的喂养对调节间隔。
      1. 在一般情况下，进料加入1μl0.5M的蔗糖为约每小时的喂养和调理之间的等待时间，以确保蜜蜂生存区间却是足够只在空调开始时被激励的学习条件关联。在实验室保持在一个温暖的温度，如果u唱不同浓度的蔗糖，调整供给量或时间间隔相应。
         注：由于进料的24小时空调的时间间隔，确保所有的蜜蜂都吃饱了0.5或1M蔗糖至少24小时之前，空调就开始了。在室温下，蜜蜂大约需要24小时，他们的动机是前足的调理方案反应良好。
         注意：使用的蔗糖溶液的浓度较低的进料蜜蜂比调节过程中使用作为奖励，以防止蜜蜂成为蔗糖的调节过程中所用的浓度，这可以减少学习表现¹⁸较不敏感的浓度。
      2. 喂蜜蜂在一个地区远离训练场。暴露于非条件刺激（蔗糖）中调理前调理上下文可能影响后续调理的气味。
   2. 在喂养和C之间的间隔onditioning放在台面上的蜜蜂在实验室的一个安静的区域，以避免不必要的干扰。如果实验室具有低的环境湿度，放置在与湿纸巾的塑料容器的蜜蜂的时间间隔期间。这可以防止脱水，因为当它们暴露于低湿度下长时间周期蜜蜂可能死亡。
      注意：不要在实验中改变了治理和喂养方案！使用设置和饲养蜜蜂和开始调理为每次实验，以便蜜蜂都处理过的完全相同的方式之间只有一个特定的时间间隔。

3，调理

1. 测试的蔗糖敏感性
   1. 开始前调理几分钟，测试蜜蜂的动机通过触摸触角的小液滴0.5M的蔗糖溶液（饲养过程中使用的相同浓度）来养活。不要让他们在测试中进食。如果他们通过EXTE回应nding其长鼻了，它们可能充分地主动地学习和可用于该协议。
2. 实验设计
   注：此协议可以进行修改，以适应学习协议繁多，以探讨蜜蜂的学习和记忆能力的诸多方面。在众多的参数可以被调整的是：间试用期，培养在给定的时间，刺激间间隔，类型和浓度以及气味，类型和非条件刺激的浓度，数量和序列的数目的蜜蜂数试验（ 图1，表^{1），19-21。}当设计针对每个空调试验的精确协议，这是非常重要的，以保持不同个体一致的试验间隔。跨试用期太短，太长或不一致会影响蜜蜂的性能。看到讨论一个完整的治疗这个话题。
   注：蜜蜂旨意更快，如果他们是在一个温暖的环境中学习的任务。因此，保持训练环境的一致性和温暖（29-30℃，如果可能的话）的温度。
3. 交付的气味（条件刺激）
   1. 方法1
      1. 设置的气味传送系统
         1. 装入塑料20毫升注射器装有气味处理的滤纸所以它是稳定的，小的一端朝向直接在蜂的触角。将柱塞在15毫升标记和定位注射器使柱塞方便使用。
      2. 呈现刺激的气味
         1. 在每次试验开始时，将线束的蜜蜂在空调领域的联系汇率制度，其触角直接指着气味盒。让我们开始刺激的气味，以减少中断造成的气味刺激时其视觉环境的急剧变化前的蜜蜂适应竞技场15-25秒。
            1. 如果蜂开始到气味盒后马上就被放置在调节竞技场响应，可能有异味在盒的前端。用不起毛的组织浸泡在70％酒精清洗墨盒脱去污染的气味。如果不解决这个问题，请更换墨盒。
         2. 按注射器的柱塞以平稳的速度，以便将柱塞4秒钟内完全压下。显示器呈现无条件刺激之前，蜜蜂的回应气味。
         3. 在每次试验中，让蜜蜂在休息调理舞台另一15-25秒。移动蜜蜂太快了审判后会显著减少每个调节试验的有效性。
   2. 方法2
      1. 设置的气味传送系统
         1. 气流源和流量
            1. 作为源气流的气味传递用一个水族馆泵增氧机或实验室工作台上加压送风，如果实验室配备了它。
               注：典型的鱼缸增氧机油泵将有近400个ml / min的气流速度（7毫升/秒）;在4秒的刺激气味，28毫升空气将流经1ml的墨盒。
            2. 用在线路的流量计与空气输送装置的管来调节流量的空气供给率。调整流量计直到流速为400毫升/分钟。检查流速在气味盒的一个单独的流量计的开口。
            3. 通过塑料管和阀门的系统连接的气流气味盒。
               注：下面讨论的计时装置打开阀门在审判中适当的时间。塑料连接器通过鲁尔型连接到墨盒的注射器针筒装上通风系统异味盒。
            4. 无论气流源，定期检查流量马柯确保线完好无损，流速维持在所期望的速率。
      2. 自动除臭交付
         1. 使用可编程逻辑控制器（PLC）来自动气味的传递。
            注意：PLC编程，打开阀门的气味输送气流6秒启动程序（通过按下一个按钮启动）后，保持阀门打开，持续4秒，并发出声音信号喂养，通过一个小喇叭，后气味刺激发病3秒信号实验者提供蔗糖。
         2. 用一个小的LED指示每个审判期间的气味刺激的时机。如果可能的话使用红色LED，因为蜜蜂的光感受器是由长[红色]波长和较短的走向[紫外线]波长转移开来，使他们看不到它做好。定位LED背后的蜜蜂以下，他们的视野之外，所以光线不会成为一个无意的条件刺激。
            注：LIGHT也有助于验证PLC工作正常，并在试验过程中试验分析蜜蜂的答复录像非常有用。
      3. 排气系统
         1. 设立一个排气系统的蜜蜂后面，帮助拉风过去的蜜蜂和疏散气味载货空气从空调竞技场保持独立时间表的气味每个演示文稿。
            注意：如果在实验室真空系统，修改真空口和连接机管路的管道，提供疏散调理舞台上所需要的气流。如果没有一个真空系统，小型电动风扇收纳在与干燥机的管线导致通风橱或通过窗户将是足够的。
      4. 在每一天的开始，检查气味输送系统和排气系统的电和空气连接。按气味输送系统上的启动按钮和跟踪按下的时间间隔按钮，当阀门打开（一个安静的点击和LED灯亮起），并在提示，目前的非条件刺激（蜂鸣声）的声音。通过将湿润的指尖在将要附着到气味盒中的连接器的前部检查空气输送。应该有一个强大的空气流，只有当阀门打开。通过举办无绒组织到排气系统的开放，以确保气流足够强大妥善疏散空气从空调领域的检查排气系统。
   3. 安装的气味盒
      1. 放置一些橡皮泥无论是在柜台还是在一个小有机玻璃站到排气系统的正前方位置的蜜蜂和气味盒。将玻璃注射器的气味在粘土和调整，使开放在广角端对准蜜蜂的头。注射器的结束应该是1-2厘米的蜜蜂。接在该范围内的距离，并是恒定的。
      2. 可靠地将墨盒连接到空气管和阀系统在注射器的窄毛玻璃端嵌合。
   4. 呈现刺激的气味
      1. 在每次试验开始时，将驾驭蜜蜂在空调领域的联系汇率制度，其触角直接指着气味盒。开始的刺激气味，使它成为习惯新环境之前，让蜜蜂休息的舞台上15-25秒。
         请注意：如果蜂开始被放置在调节舞台之后立即响应的气味盒，有可能是气味在盒的前端。用不起毛的组织浸泡在70％酒精清洗墨盒脱去污染的气味。如果不解决这个问题，请更换墨盒。
      2. 按下启动按钮来启动的气味传递的计时机制。监控蜂的回应后，刺激气味发病和演示非条件刺激前。
      3. 在每次试验中，让蜜蜂在休息调理舞台另一15-25秒，以允许初始记忆的形成。移动蜜蜂太快了审判后会显著减少每个调节试验的有效性。
4. 交付的蔗糖（无条件刺激）
   1. 方法1
      1. 对于这种方法，用牙签交付的蔗糖。
         注：最好用塑料牙签，因为牙签木能有一个气味会影响蜜蜂的反应条件刺激。
      2. 浸牙签的尖端进入蔗糖溶液，和，当它的时间来呈现非条件刺激，保持牙签在蜂的前面和允许蜂舔从牙签的蔗糖为约1秒。
      3. 定期更换牙签，避免苏建设crose。
   2. 方法2
      1. 蔗糖输送系统
         注：更准确的方法来实现非条件刺激是通过利用微米的注射器，它可以准确地提供少量的蔗糖奖励（一微升的十分之一）的。
         1. 风注射器的微米背面尽可能。加载微米注射器管的蔗糖溶液。确保有玻璃部分无气泡和组装的注射器。将其放置于注射器管的窄端之前填充的蔗糖溶液中的针的轮毂。为了确保在针的流体实际上是蔗糖，而不是水冲洗针，开始实验前风微米前进1-2微升。
   3. 蔗糖介绍
      1. 持针从蜂约2厘米的前端，而气味的方法。使用训练场的边缘，以防止晃动注射器的运动可以分散的蜜蜂。不要让针太近预期喂养信号，因为这也将过早从气味蔗糖转移蜜蜂的注意。
      2. 只要喂养信号响起，轻轻触摸天线，直到蜜蜂扩展其长鼻，再喂蜜蜂。这应该只需要一个很轻的触摸或两个天线。
         1. 0.2和0.8μL之间使用的奖励金额。蜂应该容易消耗分配给非条件刺激（〜1-2秒）的时间周期内整个液滴。不要用“ 随意 ”，从一个大的液滴，使蜜蜂食几秒钟，但不能完全消耗喂养。
         2. 关注蔗糖天线，这将减少蜜蜂的回应奖励随后介绍的建立。修改喂养过程，如果发生这种情况。
         3. 保证了气味的精确配对提示和蔗糖的奖励，确保口气后，尽快提交的蔗糖溶液液滴的蜜蜂。
            注：在CS（气味）和美国（蔗糖）的发作之间的时序是至关重要的。理想情况下，气味演示和蔗糖陈述应该简单地重叠。如果超过几秒钟的CS的端部和输送美国相隔，调理性能会减弱。

4，测试

1. 继空调使用非增强型测试试验，以评估如何做好蜜蜂教训和/或记住的空调协会。
   注：请参阅讨论对蜜蜂的反应，无筋测试试验，除了蜜蜂在分析了空调性能的试验和测试试验和气味试验的一些目的解释的重要性的详细说明。
2. 整理时间
   1. 以下空调，无论是管理即时测试试验或让蜜蜂休息经过盘整期。
      注：巩固期的长度，调节和测试之间的时间间隔，将取决于实验的目的。如果目的是考察学习差异或短期记忆，蜜蜂'的测试试验性能紧接或调理后几个小时进行评估。如果实验是研究长期记忆的测试试验，应至少提前24小时调理结束后。
   2. 如果测试试验超过24小时以下的空调，每天喂蜜蜂饱食与0.5M的蔗糖以下空调和至少一次之后，直到测试试验前12-24小时。
      1. 为了确保蜜蜂已经达到饱食，喂他们每个人的几个不同的时间，直到他们不再延长其长鼻响应触摸自己的天线e为蔗糖。他们可以消耗高达40微升，达到饱食。
   3. 让蜜蜂在湿润的容器中，以防止在整顿期间的干燥剂和死亡。
3. 测试试验
   1. 测试只能使用新制备的气味墨盒。
      请注意：用于采集该墨盒可差动耗尽，所以测试刺激将不会在试验中，气味，和个人蜜蜂一致，因此，可以显著影响结果的一致性和稳定性。
   2. 在测试过程中，如在实验的调理阶段使用维持相同的试验间隔等参数。
   3. 在测试试验中不存在非条件刺激，由于奖励的存在将改变蜜蜂的响应条件刺激，潜在地掩蔽调理协议或治疗的更微妙的影响。
   4. 所有的纪录影片ØF表示测试试验，以便能够在以后测量多个方面蜜蜂的反应气味（S）。

5，记录蜜蜂的回应

1. 二进制（有/无）市盈率的评分
   1. 在空调试验和测试过程中使用的试验每一个二进制评分系统。得分为正或负的反应;这是令人满意的多种分析用的每个处理组20-40蜜蜂的样本大小。的响应的精确拓扑结构可能是复杂的^22。它建立了一个易于看到和评分标准进行了积极的响应是很重要的。
      1. 分数蜜蜂的反应为阳性（+），当蜜蜂扩展其长鼻超出连接打开的下颌骨的提示做就行了。只有进球了积极的回应，当蜜蜂的气味后发病，但气味抵消之前扩大其长鼻。
      2. 分数蜜蜂的反应为阴性（ - ）时，有没有Ë军事攻略或者如果长鼻时的加臭剂的偏移后延长试用期间长鼻的。
      3. 不要试图将比分局部反应。为了使更精细的区分，在蜜蜂的行为，请使用下面介绍的视频分析技术。
2. 附加PER测量视频分析（ 电影1）
   1. 通过分析蜜蜂的回应视频，气味搜集行为测试的更多信息。
      请注意：这些测量也可以提供更高的时间分辨率为检查蜜蜂的响应的气味，特别是当没有在PER的治疗组之间存在/不存在评分的差。
   2. 录制视频
      1. 请务必使用未增强测试或灭绝试验的录像。奖励的存在将改变蜜蜂的响应于气味，修改长鼻持续时间延长。
      2. 设置一台摄像机以上的训练场三脚架和集中在相机上蜜蜂的头前，让触角和喙是大家关注的焦点。
      3. 定位小的LED灯，其指示气味刺激呈现，在蜂后面的区域是可见的视频，以便用它来识别气味发病和分析过程中的偏移量。
      4. 开始录制的气味发作前20秒，并继续记录至少20秒后，异味扰民蜜蜂前偏移。
   3. 视频分析
      1. 上传视频到视频编辑软件，如iMovie中或Final Cut Pro中，以测量在特定的视频帧之间的时间间隔的能力。
      2. 分析蜜蜂的响应气味为开始于刺激的气味（ 例如 ，10或20秒）的发作的离散时间周期。
      3. 使用评估按照以下常见的测量：
         1. 测量持续时间长鼻延伸，这是该长鼻延伸超出下颚到颌骨线（上述）的总时间的。
            注：蜜蜂可扩展和10-20秒的时间窗内收回其长鼻多次。单独测量每个长鼻延伸，并计算出总的持续时间。分析每个个别长鼻延伸的数目和持续时间也可以提供有价值的信息。
         2. 测量长鼻延伸，它是气味发作之间的时间，在LED灯亮，并且第一长鼻扩展的延迟。
         3. 计数和时间舌扩展相对于发病的加臭剂的，第一延伸，或其他时序参数。
         4. 跟踪触角运动^23，这也显示出特有的气味为导向的变化。
            注意：在电影1，触角运动已经被跟踪视频跟踪软件来说明触角运动的改变IN响应一个刺激气味。

结果

我们提出了使用上述的PER的协议的两个示例。第一个例子利用方法2，研究蜜蜂如何感知不同气味的分子相似的功能，气味作为CS ^5,24,25。第二种是使用方法1，有些必须开始时，每调节的实验用在研究实验室应采取的预防措施的一个例子。

研究像这样的已被用来形容结合蜜蜂和蛾类的嗅觉“感性空间”与生物成像¹³或电分析^26。蜜蜂组（n = 20）进行调节的气味癸醛与蔗糖联想加固超过12前锋配对空调试验（ 图3A）。大约10％的蜜蜂在一审判决后，这是正常的反应'自发'。在那之后的responde的百分比ð增长在未来几年的试验，直到蜜蜂100％的受访者在第五审判，以后每试。几项研究已经表明，这种增加的响应是特定于向前的配对状态（ 图1）相对于几个重要的控制程序^3。采集阶段后，每个蜜蜂进行了一系列的非增强型测试试验（ 图3B），其中涉及曝光的气味CS和该系统从CS中的分子结构不同其他一些增味剂。蜜蜂反应最强烈的CS。他们对其他气味物质的反应下降，作为结构的系统性变化的函数，用最不喜欢CS的加臭剂的最低响应。

在图4中，从最近的研讨会，让学生了解到，第一次的结果，如何调理用图示方法1蜜蜂。学生冷杉吨空调蜜蜂通过正向配对methycyclohexanone（MCH）和辛醇（OCT）与蔗糖加固（ 图4A）。 ％的反应是低的第一次试验和增加对后续试验，表明该蜂学到的气味蔗糖关联。有在不同程度的蜜蜂学会在不同的学生群体的条件相关。在我们的经验中，这些种类的差异可能是由于在作为CS中的异味，在方法（方法1）的不精确的元素，或向实验者的训练水平。在第三种情况下，性能迅速成为与实验者“增加经验更一致。调理后，将各蜜蜂用每气味测试两次。在已被空调与华侨城或妇幼保健正向配对蜜蜂群体，反应一如预期，强劲的空调异味（ 图4B）。

ENT“>在经历着配对至十月蜜蜂的第二组空调在平行于另一组中的气味华侨城向后配对蔗糖。倒向配对是几种类型的控制程序来演示之一，增加反应是特定转发配对，而不是由于其它进程，诸如从致敏非特异性觉醒。为了向后配对，蔗糖美国和气味CS从向后配对呈现相反的顺序是什么， 如图1所示。采集数据是未示出，因为CR不能得分给定的气味CS上介绍的蔗糖之后的呈现。正如所预测的缔调理，响应水平华侨城分别向前配对组相对于所述向后组（ 图4C）中的高。

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图1图的实验设计，使用空调向前配对。见表1本图中所使用的术语的定义。（一）政务司司长（气味）和之前与美国（蔗糖/水溶液）重叠。所示的CS和美国之间的关系是最适合调理蜜蜂和飞蛾。但最佳的ISI可以取决于空调协议和动物物种^1（B）击穿和CS，CR，美国，和UR的相对定时。这既发生前美国演讲或在非增强型“测试”试验的CR是实验方案的相关措施。

图2：气味枯竭与墨盒再利用。对于这些数据，气味盒是建立与己醇，如文中所述。己醇是常用的一种CS的PER研究;但是，消耗的实际速率将取决于气味和溶剂。墨盒，然后使用一次，持续​​4秒，每分钟超过800个试验（假设5蜜蜂/审判标准的实验，就等于40的用途）。在指定的溶剂中稀释，这是为每实验相对标准，分别为2.0M的（A）和0.2M的（B）（A，B）中的气味后，第一和第八试验通过吸附于固相上进行取样微萃取（SPME）纤维是当时脱附到气相色谱仪。根据峰的相对面积的第一次试验相对于第八两种溶剂后和两个浓度较高（秩配对符号秩检验p <0.05 [*]或更大），这表明较少的气味被从暗盒传送后盘盒已被使用的次数（C，D）示出刚刚在第八TR相同的数据 IAL与y轴展开。它表明，耗尽是稍大于相对于矿物油的己烷，但仅在较低的浓度。

图3采集和测试用癸醛作为CS和方法2调理。 （一）试行按试验在12前锋配对试验（ 图1）缓解（CR）。数据来自空调四组，每组5蜜蜂N = 20蜜蜂。 ISI的是3秒和ITI为6分（B）的使用，从癸不同碳链长度和/或羰基的碳的位置的气味非增强型测试。气味被提出在横跨四个组的随机序列，并且为了避免在CR的消光分别穿插着增强试验用癸醛（每两至三次试验）。

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从车间图4的数据在此期间，研究生进行了培训 ，从三组条件，以辛醇蜜蜂用每个方法一，（一）数据采集（N = 23和15的全球定位系统1和2，分别） 来调节蜜蜂和甲基环己酮组（n = 10），（二）在未增强的测试，两者气味的CR。四项试验中随机序列各组提出。（三）非增强型测试，既气味两组蜜蜂，一个正向的配对（1的Gp，N = 23）和一个落后的配对组（n = 25）。

期限（缩写）	定义	相关的例子
条件刺激（CS）	á刺激是引发很少或没有回应，在第一和美国发出信号	气味
条件反应（CR）一个	与美国关联之后到CS的响应	长鼻延长
非条件刺激（美国）	这引起了响应。一种生物学显著刺激	蔗糖/水溶液
无条件响应（UR）一个	与美国的反应	长鼻延长
各国刺激间隔（ISI）	发病的CS的美国和发作之间的时间	气味蔗糖区间
跨试用期（ITI）	单个动物相继CS美配对之间的时间	气味（试行n）的气味（试行N + 1）的时间间隔

表1林portant术语。请参考图1对这些术语的说明^a。对于每调理CR和UR是相同的，虽然其他类型的关联和反射对CR和UR可以不同。

电影1。蜂蜜蜜蜂每执行后，它已习惯于以一种气味作出反应的视频。注意蜜蜂的1.5秒​​以下的气味发作大约每响应。跟踪软件映射触角的运动响应呈现的气味。绘制在视频的右上角的线条描绘的实际触角运动。两个图形在上X（左）和Y的屏幕显示触角运动的底部（右）坐标。图中的垂直线，在视频显示表明，从左到右，光开，PER，不亮和长鼻回缩。

讨论

该协议提出了使用每次操作空调2可靠的方法。这是两个的几种方法已被成功地应用^27，21。我们采用方法2，使用市盈率，因为它是一贯可靠的，甚至可以跨越不同的实验者所有的实验研究。

相同的基本过程已经适应了许多不同种类的研究，蜜蜂，包括使用不同的条件性刺激和不同的行为反射的。它也被链接到的差异的遗传基础的调查，在学习^28,29，在大脑^13,14,30嗅觉感知和记忆的生理相关因素，以及行为^15,16,31的调节和分子遗传学基础。由于嗅觉学习蜜蜂生态相关的先进知识，这在100多年前开始与卡尔·冯·弗里希的首批研究 ^{31，每结果可以很容易地连接到一个群体的生存需要。最近，已经适于农业研究，以农药和环境毒素17的亚致死行为效应。}

基本程序是在于其可应用于研究其他物种的问题，以及强大。两个蛾类， 烟草天蛾和海灰翅夜蛾 ，已经使用的PER的研究来探讨气味的识别和各物种的嗅觉学习能力^32,33的神经基础。每实验果蝇提供了许多见解参与chemosensation和学习³⁴的分子信号级联反应。每近来被用来研究习惯的跳蚤（Rhodnius蝽 ^）35，一个重要的病媒。

在一般情况下，该过程是健壮的变化的方法;采用的Different方法可能会产生治疗组之间相同的相对差异。尽管相对简单的过程，有几个问题可以在时间防止蜜蜂学习的气味蔗糖的关联。下面的主题是可能改变的协议，一些在市盈率空调可能出现的一些常见问题。

数量上的考虑和试验类型的调理协议

学习任何协议都需要蜜蜂暴露了一些在采集阶段的试验。这个数目在很大程度上取决于任务的难度。蜜蜂能学会审单后，一个简单的任务，但他们至少需要三个试验诱发长期记忆的形成。正如所料，蜜蜂需要显著更多的试验，以充分了解一项艰巨的任务。通常，存在试验超出该蜂不再显著提高的最大数目IR的表现。该最大值取决于特​​定任务时，气味的类型和浓度，以及在蔗糖浓度。

当使用多于一种类型的试验用不同的气味，呈现出不同的试验类型中的伪随机序列，以保持蜜蜂从记忆的气味演示了一个简单序列，而不是学习的气味³⁶之间的差异。在这些伪随机序列，必须有相等数量的试验中对每个气味类型的。此外，一种香型审判的可能性正在前面和后面相同的气味，或其他任何异味，必须等于所有的气味。二气味 - 甲乙 - 使用下面的顺序：ABBABAAB。在八项试验每个气味呈现四倍。串连相同的序列，以达到试验每个气味的期望数目。

无论是实验设计的，也有必须保持一些参数常数以优化学习。 CS和美国之间的重叠是有效的调节至关重要。该试验间隔（ 图1，表1）需要是常数并且被优化，因为不规则或太短或太长试验间隔可以显著影响调理方案¹的效果。

在行为测试试验中的重要性及设计注意事项

在一个实验中，当CS和美国一起呈现的“采集阶段”记录的反应，可能是有用的。不过，要注意的气味呈现条件不同于一种试验到另一个。在增强试验中，气味接着蔗糖，提出结合视觉刺激（装置移动用于输送蔗糖液滴）可以影响蜜蜂的响应。和蜜蜂只有3秒s到显示的响应（4秒气味刺激减去与蔗糖陈述所述一个秒的重叠， 图1）。如果实验涉及的蜜蜂学习区分2气味（ 如钢筋和无钢筋），未增强的气味呈现交替试验时不会奖励呈现的视觉刺激和蜜蜂有整整四秒的时间。因此，应对这两个气味是不是采集过程完全可比。对于任何调理协议，不收购曲线¹只依赖。为了更好地确定哪些蜜蜂了解到，推出了一系列的非增强型测试试验，在此期间，没有气味增强，从而确保所有刺激试验时间相同的条件下进行。

根据实验的具体目的，测试可以由经调节的气味或一系列的试验与空调外径的单个试验的试验或或空调，新气味的组合。在空调异味的单个测试试验提供的蜜蜂是否还记得空调异味的简单分析。然而，响应于所述第一测试试验可能反映了蜜蜂动机水平以及对调节后的气味的召回。的一系列测试的实验中，无论是串联的空调气味或一系列的条件和一个或多个新的气味的单一测试的消光的实验中，也可以被用来评估存储器。该系列灭绝试验可以评估的蜜蜂多么强烈还记得空调协会。该召回强更多扑灭条件反应所需的试验。一系列的条件和新的气味单一测试也可以评估的特异性的调节气味的蜜蜂的记忆。

此外，还必须进行调理，同时测试对照和处理组在相同的时间点。对比例空调要保持较长时期的蜜蜂后不久，荷兰国际集团蜜蜂的表现是因为接触到蔗糖美国的蜜蜂喂以饱食的问题。例如，长的时间间隔之后的降低性能可能是由于存储器腐烂，或者它可能是由于由未增强曝光感应与美国变化的激励状态和/或学习，使得结果模棱两可。因此，治疗组的性能应始终判断相对于对照组的空调，并在同一时间点进行测试。

臭气浓度和完整性

有几种方法，其中所述气味（CS）的浓度和完整性可能会受到影响。最普遍的问题与气味递送的气味墨盒耗尽从过度使用（ 图2）。更换墨盒10-12用途（每2或3项试验为5蜜蜂组），以避免这一缺陷。同样重要的是使用新鲜的墨盒测试试验，因为用过的碳粉盒可耗尽的差异，因此目前不平等的刺激气味。另一个常见的​​问题是气味盒污染由于使用盒，一个以上的气味不完全清洁它。脏或被污染的空气流动也无意引入额外的嗅觉刺激（活性炭过滤器可以防止后台污染）。 PER调理与生理反应的气味测量耦合时，这是特别有问题的。漏气味墨盒出现问题，因为蜜蜂暴露于气味试验开始前，从而降低了刺激气味的显着性。在空气供给对气味输送宽松可导致很少或没有气味输送当阀打开时，人为地降低了蜜蜂响应于预定的气味。

蔗糖溶液和非条件刺激（奖励）

在A安装，浓缩，并作为美国的蔗糖溶液的完整性是对实验的成功是至关重要的。调节是作为美国³⁷的量和蔗糖水溶液浓度的函数。在方法2中使用的微米注射器允许非常精确（下降到0.2微升）控制美国的交付，我们建议您使用它们的描述这两种方法。用牙签（方法1）是足够的情况下，其中昂贵的注射器不能用，比如，在训练大群学生，在外地工作，或以较低的预算。认真执行方法1是罚款，只要定时保持着定期更换牙签，避免蔗糖的积累（和交付的浓度）。但是，使用牙签它更难以准确地控制和估计量和美国的幅度传递，其用于调节的研究¹重要。蔗糖的所需浓度提供足够的奖励，以保持主动地学习了空调协会可以根据操作任务的难度和蜜蜂的内部状态或一年时间的蜜蜂。更困难的任务需要蜜蜂的成功学习任务更高的蔗糖溶液。即使在5℃的蔗糖溶液模具可累积，这将危及该解决方案的完整性，在实验过程中影响了蜜蜂的健康和感知的奖励。这是最好的替代解决方案，每隔几天。

精密，定时，以及CS和美国交付的一致性

关于正确实施每道工序，或与此有关的任何调理过程中，最关键的问题涉及精度，时间和CS的一致性和美国交付（ 图1）。调查谁是新的程序往往是不精确的约交付一个或两个刺激。三军情报局的未能以允许重叠的CS和US导致空调性能不佳。 PLC的自动的可听信号，用于实验者气味输送发病后交付蔗糖3秒。调查人员应持有的蔗糖/水滴接近蜜蜂的信号后，迅速交货。这些程序帮助夹带一致的ISI。通过调节舞台上放置一个秒表，以及允许在审讯方便的时间作为安置之前和分娩的刺激后，监测蜜蜂一次在舞台上。这样的ITI的可以是相对一致的并且整个过程可以在受控的速度下运行。 ITI的过短，例如小于1分钟，或太长会导致空调性能差^1。

对蜜蜂业绩的季节性，环境和语境效果

蜜蜂的表现可以用它的周围被显著影响之前和调节过程中。通常情况下，来与四季变化的温度和食物供应的波动会改变蜜蜂的学习动机。当鲜花盛开，蜜蜂的学习动机在实验室条件的关联降低^38。当殖民地强调 - 从极端温度，食物短缺，或疾病有关的压力 - 蜜蜂'将显示在他们的学习表现下降。蜜蜂不停地在飞行的房间可以好好学习了一段时间，但有太多的疾病的压力和老化随着时间的推移他们的学习表现。调节过程中的环境还可以降低蜜蜂的表现。任何多余的气味，运动和其他刺激可以从实验的刺激分散的蜂。为了避免这个问题，保持了相当一致，简化的视觉环境。

基因型和经验影响每场演出

蜜蜂工人可以在性能明显不同于任何调理过程由于任务专业化，基因型，或其他环境因素^20。因此，标准化，尽可能地，用在一个实验中，以动物的类型，以减少个体间差异是很重要的。在领导的开放式交配女王，这意味着她交配与许多不同的无人驾驶飞机的殖民地，工人将不同的父本基因型。遗传背景可导致感官反应³⁹戏剧性的差异和学习表现^29。使用菌落率领皇后工具性从单一的无人机²⁸人工授精精子减少这种个体间差异。

以上所述的协议，包括用于从巢入口收集蜜蜂工人的方法。然而，这些蜜蜂彼此在考虑年龄或行为的任务不同。他们可能是年轻（inexperienCED）以上（比较有经验）觅食。他们可能是年轻的蜜蜂使他们的第一个方向飞行。或者，他们可能是守卫的蜜蜂。为了减少变异，标志着具有快干磁漆或标识标签蜜蜂要么因为他们脱颖而出，成为成年人（控制年龄）和/或他们开始觅食（以控制经验）。然后，几天后，收集标记的蜜蜂进行调理。在从事护理工作者的行为可以从蜂巢中的帧进行收集。护理人员可当他们将他们的头到育雏细胞喂养和照顾幼虫内被验明正身。

用处女皇后或无人机每调理

除了 ​​工人蜜蜂，处女蜜蜂蜂王和雄蜂可以很容易调节的市盈率过程的研究旨在发展蜜蜂在不同的学习表现²⁸的遗传线路。处女蜂王应尽快日之后收集安永从化蛹出现，并直接放入约束的线束没有麻醉。从殖民地内育雏梳收集年轻，不成熟的无人机一般都不会主动地学习。之后，他们已经开始交配飞行，无人机很容易了解每任务^28。因为他们从配合航班返回，并维持隔夜在一个小笼子中用于饲养女王的殖民地，他们应该被收集。不要试图调节的前一天，以利用它们;他们没有在一夜之间吊带存活良好。一对夫妇的前调理小时的无人机可以从笼子里被收集并放入约束的线束没有麻醉。

结论

此PER程序，在方法的方式，相当于一个起点设计PER实验。最PER协议将要求概述以某种方式来改变的程序来实现的实验和accommodat的具体目标E倍数治疗组。这是很容易实现。然而，正确的实施需要对细节的关注和实践。一旦掌握了它可以是一个功能强大的程序添加为研究工具用于不同的昆虫种类数的基础和应用研究项目。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378-1KG
Odorant Compounds (for example)
1-hexanol	Sigma-Aldrich	471402-100ML	For additional examples
2-octanone	Sigma-Aldrich	W280208-800G-K	of odorants, see any of
heptanol	Sigma-Aldrich	51778-5ML	the papers on olfactory
gerianol	Sigma-Aldrich	163333-25G	processing from the
nonanal	Sigma-Aldrich	131210-100ML	Smith lab.
Hexane	Sigma-Aldrich	296090-1L
Heavy mineral oil	Sigma-Aldrich	330760-1L	Make sure it’s odorless.
Ethanol	Sigma-Aldrich	459836-1L
Scintillation vials	Sigma-Aldrich	Z190535-1PAK	Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials.
Bee harness			Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing.
Duct tape
Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956-1PAK
Wash bottles	Sigma-Aldrich	Z560847-3EA	For the 70% ethanol.
Dryer tubing
FOR METHOD 1 ONLY
20 ml disposable plastic syringes	Cole-Parmer	WU-07945-18
15 mm filter paper circles	Sigma-Aldrich	Z274844-1PAK
Pushpins
Toothpicks
FOR METHOD 2 ONLY
Gilmont Micrometer syringe, 0.2 ml	Cole-Parmer	EW-07840-00
Gilmont micrometer syringe tip	Cole-Parmer	EW-07841-00
26 G 3/8” Leur hub hypodermic needles	Fisher Scientific	14-826-10
1 cc tuberculin syringes (plastic/glass)	Sigma-Aldrich	Z181641-1EA OR Z192090-200EA	Glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses.
Small rubber/silicone restrictors	Cole-Parmer	EW-95702-02	Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers.
[header]
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
75 x 100 mm filter paper	Sigma-Aldrich	Z695106-500EA
Direct Logic 05 Programmable Logic Controller	Koyo Electronics Industries Co, Ltd
1 mm, 4 mm, & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing	Cole-Parmer	Various	Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing.
Polypropylene connectors & leur fittings	Cole-Parmer	Various	Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes.
65 mm Correlated Flowmeter	Cole-Parmer	EW-03216-08	Aluminum with glass float; for liquids and gases, with valve.
OR
Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump	Aquacave	AE-TETRA-300
LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E"	The Lee Company	LFAA1200118H	Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280 mW
PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer	RadioShack	273-074