阿普利西亚 单一神经元电生理学和分子分析的甘利亚制备

摘要

海洋蜗牛 阿普利西亚卡利福尼卡 已被广泛用作神经生物学模型，用于细胞和分子行为基础的研究。这里描述了一种探索 阿普利西亚 神经系统的方法，用于识别神经回路单神经元的电生理学和分子分析。

摘要

神经生物学的一个主要挑战是了解控制特定行为的神经回路的分子基础。一旦确定特定的分子机制，就可以开发新的治疗策略，以治疗退行性疾病或神经系统老化引起的特定行为中的异常。海洋蜗牛 阿普利西亚卡利福尼卡 非常适合研究细胞和分子的行为基础，因为神经电路背后的特定行为可以很容易地确定，电路的各个组成部分可以很容易地操纵。 阿普利西亚的 这些优点导致了学习和记忆神经生物学的几个基本发现。在这里，我们描述了为个体神经元的电生理学和分子分析准备 的阿普利西亚 神经系统。简言之，从神经系统解剖的结膜暴露在蛋白酶中，以去除结膜护套，使神经元暴露，但保留神经元活动，就像在完整的动物中一样。这种制剂用于对单个或多个神经元进行电生理测量。重要的是，使用简单的方法进行记录后，神经元可以直接从神经中分离出来进行基因表达分析。这些协议用于同时进行L7和R15神经元的电生理记录，研究它们对乙酰胆碱的反应，以及在分离的单L7、L11、R15和 阿普利西亚R2神经元中对CREB1基因的量化表达。

引言

人脑极其复杂，有近1000亿个神经元和数万亿个突触连接。几乎有同样数量的非神经细胞与神经元相互作用，并调节其在大脑中的功能。神经元被组织成调节特定行为的电路。尽管我们对大脑功能和神经回路的理解有所进步，但对于控制特定行为的电路组件的身份却知之甚少。了解电路中各种成分的身份将大大促进我们对细胞和分子行为基础的理解，并有助于制定神经精神病的新治疗策略。

海洋蜗牛阿普利西亚卡利福尼卡一直是确定神经元电路的基础特定行为^1-14的工作马。阿普利西亚神经系统包含大约20，000个神经元，这些神经元被组织成9个不同的神经质。Aplysia的神经元很大，可以根据它们的大小、电特性和在神经中的位置轻松识别。阿普利西亚有丰富的行为，可以研究。研究良好的行为之一是刺退出反射 （GWR）。这种反射的中心部分位于腹部结节。已绘制 GWR 电路的组件，并确定各种组件的贡献。重要的是，GWR电路经历关联和非关联学习^{5，6，15-19。}数十年来对这种反射的研究也发现了几个信号通路，这些信号通路在^{学习和记忆20-24}中起着关键作用。

几种不同的 阿普利西亚 制剂用于研究记忆存储的细胞和分子基础。其中包括完整的动物^2，3，半完整的准备^{1，7，13，14，16} 和重建神经电路的主要组成部分^25-29。这里描述了为探索 阿普利西亚 神经元电路的电生理学和分子分析而减少的准备。研究了以下四个已识别的神经元。R15，一个爆裂的神经元，L7和L11，两个不同的运动神经元和R2，一个胆碱神经元被研究。R2是无脊椎动物神经系统中描述的最大神经元。简言之，该方法涉及结节蛋白酶治疗、药理治疗前后的电生理测量以及单个神经元的分离，用于基因表达的定量分析。这种方法使我们能够将分子分析与多个神经元同时记录相结合。这种方法通过配对细胞内记录成功地用于研究R15和L7神经元对乙酰胆碱（Ach）的反应。经过电子生理测量，R15和L7以及L11和R2等其他已识别的神经元被分离出来，用于定量聚合酶链反应（qPCR）对CREB1表达的分析，CREB1是记忆存储的重要转录因子。

研究方案

1. 准备腹腔甘利亚，电生理测量，和隔离单一识别神经元从阿普利西亚加州的腹部刚利翁

1. 在实验室水族馆中保持 阿普利西亚 ，在 12：12 光下在 16 °C 处循环人工海水 （ASW）：黑暗条件。
2. 腹部结肠分离。
   1. 通过注射380毫米MGCl₂ 溶液5-10分钟（相当于动物体重的30-35%）麻醉动物。
   2. 根据腹部在中枢神经系统^{中的位置24，28}识别腹部结肠。
   3. 通过手术切除黑帮，并立即储存在人工海水中，包括450立方米纳克、10米KCl、10米卡Cl2、55毫米MMMcl 2、2.5m NaHCO₃和10m HEPES（pH 7.4）。
3. 蛋白酶治疗。
   1. 在上面描述的 ASW 中稀释 0.1% 蛋白酶 （脱脂） 的培养皿中，在 34 °C ±0.5 处孵化腹部结节 30 分钟。
      注意：使用的蛋白酶数量需要随着动物的年龄和体重而标准化。一般来说，年龄较大和较大的动物需要更多的蛋白酶。
4. 去除帮派护套。
   1. 酶治疗后，将结膜固定到细胞室的 Sylgard 硅胶底座（+1 厘米;卷 = 0.3 毫升），并在室温下（18 °C ±2）与 ASW（流速：150μl/min）一起灌注。
      注意：为了提高已识别神经元的可见性，将结核放在聚碳酸酯玻璃缸（图1）的顶部（直径+2毫米修改后的细胞室），使用双目立体显微镜，可轻松从底部亮起，放大20倍和40倍。
   2. 使用钳子和微剪刀小心地从结石中取出护套。
5. 同时从两个神经元进行电子生理学记录。
   1. 识别感兴趣的神经元。
   2. 用一个具有电阻10-15 MΩ、充满3M KCl溶液的单细胞内锐利微电极来填充神经元。
   3. 使用细胞内记录系统记录神经元活动（10 kHz 带通）。
   4. 使用电子生理学软件（如轴电图）处理记录数据。
      注：人们可以很容易地从多个神经元进行记录。神经元 L7、L11 或 R15 和 R2 很容易根据它们的位置进行识别。同时从两个L7和R15神经元（图2）进行记录需要两个放大器和两个微脉动器。
6. 药物应用。
   1. 通过轻轻的管道或直接注射到神经元中，将选择的药物应用到细胞室中。
   2. 进行电生理测量。
      注：根据实验目标，可以测量神经元的不同电生理参数，如药物应用前、应用期间和之后膜电位 （MP） 或行动潜力 （AP） 的变化。
7. 单个神经元的隔离。
   1. 在电生理实验结束时，停止ASW的灌注，用100%乙醇清洗结膜。 接触乙醇会使神经元石化，并使用细钳，在不损害神经元的情况下，很容易去除单个神经元。
   2. 在立体显微镜下取出单个神经元，并转移到含有冰冷 500 μl RNA 提取试剂的小 Eppendorf 管中。孤立的单个神经元可存储在 -80 °C 的 RNA 提取试剂中，以便将来进行分析。

2. 通过定量实时 PCR （qPCR） 与单一神经元和基因表达分析的 RNA 隔离

1. 尽量减少RNA退化的预防措施：
   核糖核酸（RNases）降解RNA，是非常稳定和活性酶。在处理RNA时采取以下步骤。
   1. 用 RNase 停用剂清洁工作区域和仪器。
   2. 在处理RNA时随时戴手套，并经常更换手套。
   3. 仅使用无RNA的RNA。
2. 将RNA总数与单个神经元分离：
   1. RNA隔离的标准三佐尔协议可用于将RNA与单个神经元分离。简单地将 20% v/v 的氯仿添加到 Trizol 中，通过短暂的漩涡很好地混合。
   2. 将管子放在旋转器上 10 分钟，在 4 °C。 在 12，000 x g 下旋转三氯仿混合，在 4 °C 下旋转 15 分钟。
   3. 收集水相并转移到新鲜管。
   4. 加入醋酸钠溶液（pH 5.5），最终浓度为0.3M、100 ng/ml的共生糖蓝和2.5卷100%乙醇沉淀RNA。
   5. 将样品混合好，在-80°C的夜间孵化。
   6. 在 4 °C 下以 12，000 x g 旋转样品 20 分钟，在管子底部可以看到一个小的蓝色颗粒。
   7. 取出超自然剂，在 4 °C 下用 850 μl 的 75% 冰冷乙醇在 12，000 x g 下洗净颗粒 10 分钟。
   8. 小心地取出超细剂，将RNA颗粒空气干燥7-10分钟，最大。
      注意：确保RNA不会像过度干燥那样长时间干燥-干燥RNA颗粒会使溶解变得非常困难。
   9. 干燥后，将RNA颗粒在10微升的RNA酶无水中补充，并确定RNA浓度。
      注：使用光谱仪确定RNA浓度。不立即使用时，将RNA存储在-80°C。
3. 单个神经元的 aRNA 合成：
   1. 使用市售的线性RNA放大系统放大RNA（根据实验目标进行一到两轮）。
      注：来自单个神经元的RNA总数在~10-60 ng之间。第一轮放大的预期收益率为+100-300 ng，第二轮放大为+0.8-1.5微克RNA。
4. RNA 的反向转录：
   1. 要从 aRNA 生成 cDNA，请在 20μl 的反向转录反应中使用 1.0μg 的 aRNA。为此目的，有几个套件可在商业上提供。
      
      注：cDNA 是根据制造商的协议，使用热循环器上的以下设置合成的。
      5 分钟，25°C
      30 分钟，42 °C
      5 分钟，85 °C
      保持在4°C
   2. 反向转录步骤后，将 cDNA 存储在 -20 °C 以进行长期存储。
5. 引言设计和标准化：
   有几个优秀的软件程序是免费的，用于设计实时放大的引物。
   1. 选择 18-24 mer 寡核苷酸，生产 70-110 bp 放大器，并使用商业来源合成引物。
      注：应为每个感兴趣的基因设计两到三个引言对。每个引号集都需要通过 qPCR 进行标准化。用于基因CREB1（图4）的前向和反向引数对如下：
      
      引号集 1
      前进： 5'-塔加特加-3'
      反向： 5 '- 阿卡格加加特加加 - 3'
      引号集 2
      前进： 5 '- 阿加特加特加加加 - 3'
      
      反向： 5 '- 加卡卡加加塔特加卡 - 3'
   2. 要选择用于下游分析的最佳引物，请监视 ct 值和 qPCR 中放大曲线的形状。
      注：在 PCR 指数阶段，在 40 轮放大中给出 Ct（周期阈值）值在 10-35 之间的引物和平滑曲线，然后是平滑的高原，是基因表达分析的最佳选择。
6. 定量实时 PCR （qPCR）：
   注意：使用与 qPCR 机器兼容的适当管子或板。
   1. 用无核水将cDNA稀释至5倍。
   2. 到稀释的 cDNA 的 2μl，加入 8 μl 的 qPCR 主混合，其中包含 2 μl 的 H₂O、5 μl 的 2x SYBR 绿色主混合和 1.0 μl 的 10 μM（每个）前进和反向引物。
   3. 关闭管子，并在管道 cDNA 和主混合后密封板。通过轻轻敲击混合内容，在 1，500 rpm 下旋转 30 秒。
   4. 继续设置 qPCR 机器。

结果

本研究中使用的动物重量在100-200克之间。按照上述协议，我们对从2-5克到200-300克的动物分离的腹部神经元进行了电生理测量和分子分析。

蛋白酶治疗的标准化对于成功测量神经元的神经元具有重要意义。最初，使用多个蛋白酶（假发）浓度和持续时间，R15神经元的爆裂作用潜力记录为^26，31。这些测量被比较成从完整的帮派中直接（没有蛋白酶治疗）记录。在随后的...

讨论

神经元R15参与调节心血管，消化，呼吸和生殖系统^30。AP 的定期有节奏的爆裂活动是 R15 的一个功能。如结果部分所示，R15 和 L7 的配对记录显示，神经质制备保留了 R15 神经元的活性。R15和L7神经元对阿赫反应恰当。这种神经质制备可维持8-10小时，电生理活动可持续监测。因此，我们可以长期研究短暂神经递质暴露（局部暴露在特定神经元或洗澡中）的电生理效应。此外，人们还可以研究...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aplysia	National Aplysia Resource Facility, University of Miami
NaCl	SIGMA	S 3014-1KG
KCl	SIGMA	P 9333-500G
CaCl2•2H2O	SIGMA	C5080- 500G
MgCl2•6H2O	Fisher Scientific	BP 214-501
NaHCO4	SIGMA	S 6297-250G
HEPES	SIGMA	H 3375-500G
Protease	GIBCO	17105-042
Trizol	Ambion	15596-026
Chloroform	MP Biomedicals	2194002
100% Ethanol	ACROS	64-17-5
GlycoBlue	Ambion	AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5	Ambion	AM9740
Nuclease free water	Ambion	AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit	Ambion	AM1751
qScript cDNA SuperMix	Quanta Biosciences	95048-100
Power SYBR Green PCR Master Mix	Applied Biosystems	4367659
Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10 or
26002-20
Veriti Thermal Cycler	Applied Biosystems	Veriti Thermal Cycler
5430R Centrifuge	Eppendorf	5430R Centrifuge
7900HT Fast Real-Time PCR	Applied Biosystems	7900HT Fast Real-Time PCR
Amplifier	BRAMP-01R	NPI Electronics
Digidata Converter	Instrutech ITC-18	HEKA ELEKTRONIK
Micro Manipulator	Patch Star	Scientifica