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  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里，我们描述了一种表型检测，适用于小干扰合成RNA（siRNA）、化合物和 结核 分枝杆菌突变库的高通量/高含量屏幕。该方法依靠使用自动共聚焦显微镜检测荧光标记的荧光结 核分枝杆菌 。

摘要

尽管有治疗和疫苗，结核病（TB）仍然是世界上最致命和最普遍的细菌感染之一。几十年来，多重耐药菌株的突然爆发对结核病的控制构成了严重威胁。因此，必须确定新的靶点和途径，对结核病的致病剂，结核分枝杆菌（Mtb）至关重要，并寻找可能成为结核病药物的新化学物质。一种方法是建立适合大型图书馆的基因和化学屏幕的方法，以便在大海捞针。为此，我们开发了一种表型检测，依靠使用自动共焦显微镜检测荧光标记的Mtb。这种体外测定允许对Mtb的殖民化过程进行基于图像的定量，并针对 384 井微板格式进行了优化，该格式适合锡RNA、化合物或Mtb突变库的屏幕。然后对图像进行多参数分析处理，从而提供主机单元内Mtb发病机理的读取推断。

引言

在过去几年报告的新兴和重新出现的传染性病原体中，结核病分枝杆菌（Mtb）在2011年造成140万人死亡和870万新感染（2012年全球结核病报告，www.who.int/topics/tuberculosis/en/）中占有突出地位。尽管有多种药物疗法，感染人数仍在上升，耐多药（MDR）以及广泛耐药（XDR）Mtb正在迅速蔓延到世界各地1。 此外，在考虑Mtb抗原的存在时，很明显，全球三分之一的人口被认为是潜在的感染Mtb。 据统计，在十分之一的病例中，有1个病例正在向该病的活跃形式发展，随后出现临床症状2。因此，迫切需要新的手段来打击Mtb。在此背景下，我们开发了一种体外视觉表型检测，依靠自动共聚焦荧光显微镜3监测Mtb入侵并繁殖成宿主细胞。将检测结果与自动图像采集和分析相结合，在 384 井微晶板中进行适应，允许对化合物、硅RNA 和细菌突变体的中尺度库进行高含量/高通量筛选 （HC/HTS）。因此，在这种表型检测上筛选一个基因组宽的RNAi库，能够识别与Mtb贩运和细胞内复制有关的关键宿主因素，并能够阐明块茎杆菌利用的宿主通路。这种特殊的表型检测的另一个适应是识别细菌因素，这些细菌因素对Mtb内法戈索马尔的持久性至关重要。例如，逮捕法戈索姆成熟被认为是促进Mtb在巨噬细胞中生存和复制的主要机制之一。监测荧光标记酸性隔间中Mtb淘汰突变体的亚细胞定位，使参与生存过程的细菌基因得以识别。最后，Mtb的高含量成像也为量化药物效率提供了一个很好的方法，用于抑制细胞内细菌生长3等各种现象。总之，这种高通量表型检测可以加速对结核病的药物发现，这些不同方法收集的数据有助于更好地了解Mtb施加的宿主操纵。

研究方案

1. 高通量全基因组硅纳筛查

在感染Mtb H37Rv表达绿色荧光蛋白（GFP）时，在人类II型肺炎细胞模型A549细胞系中进行筛查。此过程在图 1A中概述。

  1. 用 1x siRNA 缓冲器重新存放在母板 （96 井板） 中的干燥硅纳库，以达到 4 μM 的浓度，然后将 10 μl 的混合物转移到 384 井女儿板（女儿板 1）中。
  2. 在女儿板 1 中加入 10μl 的 1x siRNA 缓冲区，将 siRNA 稀释 2 倍。siRNA 悬念后，板材用可剥落的铝密封密封，可存储在 -20 °C 至少 6 个月和长达 2-3 年，但存储时间可能会因 siRNA 库制造商的建议而异。
  3. 将女儿板 1 中的 siRNA 稀释成女儿板 2，以达到 500 nM 的浓度。siRNA 悬念后，板材用可剥落的铝密封密封，可存储在 -20 °C 至少 6 个月和长达 2-3 年，但存储时间可能会因 siRNA 库制造商的建议而异。
  4. 使用前，在室温下解冻女儿板2。
  5. 从女儿板 2 中取 2.5μl 的 siRNA，放入 384 井检测板中。
  6. 在第 1.5 步的同一 384 井检测板中，在各自的井中添加 2.5μl 负和正控制 siRNA。
  7. 将转染试剂稀释为 1x D-PBS，以产生足够的溶液，在每口井中提供 0.1μl 变异试剂，并在室温下预孵化稀释的输血液 5 分钟。
  8. 在检测板中将 7.5 μl 的转染试剂/PBS 溶液混合物添加到每个井中，并在室温下孵育 30 分钟。
  9. 加入40μl的A549细胞（1，500个细胞/井）悬浮在RPMI 1640中等补充10%胎儿牛血清（FBS）。在含有5%CO2的大气中，将细胞保持在37°C的3天潜伏期。这些细胞每24小时分裂一次，因此大约12，000个细胞在输血后三天在井中。
  10. 通过离心处理4，000 x g 5分钟，用D-PBS（从MgCl2和CaCl2免费）清洗两周前的GFP表达Mtb H37Rv培养物，并丢弃洗涤。重复此步骤 3 倍（对于GFP-Mtb H37Rv 文化条件，请参阅协议 3）。
  11. 将细菌颗粒悬浮在 10 毫升 RPMI 1640 中等，并辅以 10% FBS，在室温下减速 1 小时，使细菌聚集物沉积物。
  12. 收集细菌超自然物，并使用微板读卡器测量 OD600（OD 600应在 0.6-0.8 之间）和 GFP 荧光 （RFU 值），以确定细菌浓度。使用显示 RFU 值 = f （CFU 值） 的参考回归线计算悬架的滴定器，该线是在对在相同条件下准备的另一种文化进行实验之前生成的。准备含有2.4 x 106细菌/毫升的细菌悬浮，这相当于5的多种感染（MOI）。
  13. 取出 384 井检测板中的介质，并加入 25 μl 的新鲜制备细菌悬浮剂。
  14. 在含有5%CO2的大气中，在37°C的384井检测板中孵化5小时。
  15. 取出介质，轻轻清洗细胞与RPMI介质补充10%FBS 3倍。
  16. 要杀死剩余的细胞外细菌，请在含有 5% CO 2 的大气中，在含有 5% CO2的大气中，用含有 50μg/ml 的阿米卡辛的新鲜 RPMI-FBS 介质治疗细胞，时间为 1 小时。
  17. 去除中等含阿米卡辛，并加入50μl的新鲜RPMI介质补充10%FBS。在含有5%CO2的大气中，在37°C下孵化384井检测板5天。
  18. 在图像采集之前，在 PBS 中加入 10 μl 的新鲜制备的 30 μg/ml DAPI（最终浓度 5 μg/ml），并在 37 °C 下孵育 10 分钟。
  19. 将板加载到自动对焦显微镜中。
    figure-protocol-1848
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  20. 设置曝光参数。使用激发激光 405 nm 记录 DAPI 荧光，使用发射滤光片 450 nm，使用激发激光 488 nm 记录 GFP 荧光，发射滤波器 520 nm。
    figure-protocol-2193
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    figure-protocol-2449
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  21. 选择每口油井中的油井和要收购的油田，然后称为布局和子布局参数。
    figure-protocol-2747
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    figure-protocol-3003
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  22. 使用步骤 1.20 和 1.21 中的参数生成实验文件，并运行自动采集。
    figure-protocol-3306
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    figure-protocol-3562
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  23. 将图像传输到远程服务器。
    figure-protocol-3841
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  24. 使用图像分析软件评估图像。使用核检测算法从DAPI通道检测细胞核，使用像素强度属性算法（图4A）从GFP通道检测细菌区域。

注意：此协议进行了优化，以研究基因沉默对细胞内 Mtb 生长的影响。 Mtb 是一种生长缓慢的细菌，每 20 小时在最佳条件下分裂一次。感染后5天，在没有细胞裂解的情况下，细胞外 Mtb 的量仍然很低，不影响分析的质量。该协议必须优化抗生素治疗的长度和潜伏时间，以便使用快速生长的细菌，如 小分枝杆菌和大肠杆菌 ，广泛释放，可以感染新的细胞，以适应siRNA屏幕。

2. 高通量化合物筛选

在受感染的宿主细胞上进行筛查。此过程在图 1B 中概述。

  1. 解冻含有复合库的 384 井母板， 溶解在 DMSO 100% 中。在含有 10 μl 的 RPMI 1640 介质中，在 384 井女儿板中转移 0.5 μl 化合物，并辅以 10% FBS。
  2. 通过离心处理4，000 x g 5分钟，用D-PBS（从MgCl2和CaCl2免费）清洗两周前的GFP表达Mtb H37Rv培养物，并丢弃洗涤。重复此步骤 3 倍（有关GFP-Mtb H37Rv 文化条件，请参阅协议 3）。
  3. 将细菌颗粒悬浮在 10 毫升 RPMI 1640 中等，并辅以 10% FBS，在室温下减速 1 小时，使细菌聚集物沉积物。
  4. 收集细菌超自然物，并使用微板读卡器测量 OD600（OD 600应在 0.6-0.8 之间）和 GFP 荧光 （RFU 值）。使用显示 RFU 值 = f （CFU 值） 的参考回归线计算悬架的滴度，该线在实验前已生成。典型浓度为1×108细菌/毫升。
  5. 收获6天大的原发性人类巨噬细胞在4×10 5 细胞/毫升RPMI 1640中等补充10%胎儿牛血清（FBS）和50 ng/ml重组人类M-CSF（对于人类周围血单细胞细胞净化和巨噬细胞分化见协议4）。
  6. 在不同的 MOI 中用巴西利孵育稀释的原细胞，范围从 1-5，在 90 rpm 温和摇晃，在 37 °C 时 2 小时。
  7. 通过离心清洗受感染的细胞350 x g，去除细胞外细菌。每次离心步骤后，在RPMI 1640中等中重新吸收颗粒，并辅以10%FBS。重复此步骤2倍。
  8. 暂停在RPMI 1640中等感染细胞补充10%FBS和阿米卡辛在50μg/ml和孵育悬浮与轻度摇晃1小时在37°C。
  9. 通过离心350 x g去除含有阿米卡辛的细胞培养介质，用完整的RPMI 1640介质清洗受感染的细胞，并辅以10%FBS和50 ng/ml重组人类M-CSF。重复一次。
  10. 在第 2.1 步中，在同一检测板中加入 40 μl 受感染的巨噬细胞悬浮液，该板已包含 10 μl 的复合稀释。目前，每口油井的DMSO最终浓度已达1%。
  11. 在含有 5% CO2的大气中，在 37 °C 下孵化检测板 5 天。
  12. 用细胞渗透的远红荧光染料染色活细胞。
  13. 将板加载到自动对焦显微镜中。
    figure-protocol-5710
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  14. 设置曝光参数。使用激发激光 640 nm 记录远红荧光，使用发射滤光片 690 nm，使用激发激光 488 nm 记录 GFP 荧光，发射滤波器 520 nm。
    figure-protocol-6051
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    figure-protocol-6307
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  15. 选择每口油井中的油井和要收购的油田，然后称为布局和子布局参数。
    figure-protocol-6605
    单击此处查看更大的图像。
    figure-protocol-6861
    单击此处查看更大的图像。
  16. 使用步骤 2.14 和 2.15 中的参数生成实验文件，并运行自动采集。
    figure-protocol-7164
    单击此处查看更大的图像。
    figure-protocol-7420
    单击此处查看更大的图像。
  17. 将图像传输到远程服务器。
    figure-protocol-7699
    单击此处查看更大的图像。
  18. 使用图像分析软件评估图像。使用像素强度属性算法检测远红色通道的细胞区域，使用像素强度属性算法（图 4B）从 GFP 通道检测细菌区域。

注意：此协议可以通过用表达荧光蛋白（一口井/一个突变体）的突变体取代化合物来适应 Mtb 突变库筛选（图 1C，另见布罗丁等人） 。4）。 荧光突变体首先在井中播种（每口井20微克细菌悬浮）。然后，细菌通过30微克的细胞悬浮恢复。在离心350 x g下1分钟后，板在含有5%CO2的大气中以37°C孵育。孵化时间和 MOI 取决于检测。例如，对于早期细胞事件（如噬菌体酸化）的可视化，这些细胞可以感染 2 小时，MOI 范围为 1-20。溶酶体在含有 5%CO 2 的大气中使用 Lysotracker 染料在 2 μM 上染色 1.5 小时，在 37 °C 处，然后用 10% 甲醛或 4% 甲醛 （PFA） 固定。使用具有适当算法的图像分析脚本获取并最终分析共焦图像，用于溶酶体检测和亚细胞本地化4。

3. 绿色荧光蛋白表达结 核杆菌 H37Rv（GFP-H37Rv）培养条件

对于长期存储，GFP-H37Rv 被冻结在 D-PBS 中（每小瓶约 1 x 108 分枝杆菌）。

  1. 在含有 50 毫升 7h9 肉汤介质的 Erlenmeyer 烧瓶中补充一个冷冻库存的 GFP-H37Rv 小瓶，辅以米德尔布鲁克 OADC 浓缩 10%、甘油 0.5%、Tween-80 0.05% 和 Hygromycin B（50μg/ml）。
  2. 在37°C孵化8天。
  3. 测量 GFP-H37Rv 文化的 OD600。
  4. 稀释 GFP-H37Rv 文化，以获得 OD600 = 0.1 在新鲜的 7H9 汤介质补充米德尔布鲁克 OADC 浓缩 10%， 甘油 0.5%， 特温 - 80 0.05% 和海格罗霉素 B （50μg/ml）.
  5. 在用于检测之前，在37°C下孵化GFP-H37Rv 8天以上。

4. 人类外周血单细胞细胞从全血或布菲涂层制剂中净化

  1. 将血袋稀释2倍于1x D-PBS（不含MgCl2 和CaCl2），包含1%FBS。
  2. 通过菲科尔密度梯度离心分离单核细胞400 x g 20分钟。
  3. 收集孤立的单核细胞。
  4. 用 1 倍 D-PBS（从 MgCl 2 和 CaCl2 中免费）清洗单核细胞3倍，在室温下在 400 x g 处离心 10 分钟，含有 1% FBS。
  5. 将细胞浓缩至 1 x 107 细胞/毫升。
  6. 根据制造商的协议，使用 CD14 磁珠净化单核细胞（参见材料）。
  7. CD14单核细胞纯化后，在RPMI 1640中以1.5×10 6 细胞/毫升的种子将细胞播种，辅以10%FBS和40 ng/ml的人类巨噬细胞群细胞刺激因子（hM-CSF），在含有5%CO2的大气中以37°C孵育4天。
  8. 4天后，用新鲜的RPMI 1640取代介质，辅以10%的FBS和40 ng/毫升的hM-CSF，并在含有5%CO2的大气中以37°C孵育2天。
  9. 6天后，细胞可用于检测。

结果

高通量全基因组硅纳筛查

Mtb 能够 在体外 和其他几个肺上皮细胞中殖民免疫细胞。例如 ，Mtb能够感染和破坏通常用作人类 II 型肺细胞5-7模型的 A549 上皮细胞。Dectin-1被报告为主机细胞受体，参与 Mtb 吸收，增生反应和抗菌作用细胞内分枝杆菌生长在A549细胞8。第 1 号协议中描述的 siRNA 条件导致 85% 的沉默效率（未显示数据）。用siRNA沉...

讨论

我们在这里描述使用 GFP 表达 Mtb H37Rv 菌株感染荧光标记主机单元所需的表型检测方法，使其适合高含量/高通量屏幕。该协议可应用于广泛的化合物、荧光探头和 Mtb 突变体。对于上述每个协议，可以在图像采集之前执行固定和免疫标记步骤。我们使用配备 20X （NA 0.70） 或 60X （NA 1.2） 水透镜的自动荧光同焦显微镜来获取图像。共焦显微镜配备了405、488、561和640纳米激发激光器。发?...

披露声明

未声明任何利益冲突。

致谢

这项工作的财政支助由欧洲共同体（ERC-STG INTRACELLTB赠款n°260901，MM4TB赠款n°260872）、国家复兴银行、联邦（12001407（D-AL）Equipex想象生物医学）和加莱地区提供。我们感谢加斯帕德·德洛伊森、伊丽莎白·韦克迈斯特、安东尼诺·邦焦瓦尼和弗兰克·拉方特从BICEL平台获得的技术援助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
µclear-plate black, 384-wellGreiner Bio-One781091127.8/86/15 MM with Lid, TC treated
CellCarrier 384-well platePerkinElmer6007550Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated
V-bottom white, 384-well plateGreiner Bio-One781280 
sealing tape, breathable, sterileCorning3345 
Lipofectamine RNAiMaxLife Technologies13778150Transfection reagent
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich34943 
RPMI 1640 + GlutaMAX-ILife Technologies61870-010Cell culture medium
D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2Life Technologies14190-094Dulbecco's Phosphate Salin Buffer
D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2Life Technologies14190-091Dulbecco's Phosphate Salin Buffer
Fetal bovine serumLife Technologies2610040-79 
Ficoll Paque PLUSDutscher17-1440-03Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification
CD14 MicroBeads, humanMiltenyi130-050-201Purification of CD14+ Monocytes
Human M-CSF, premium gr. (1000 μg)Miltenyi130-096-493Macrophage Colony Stimulating Factor
LS ColumnsMiltenyi130-042-401Columns for CD14+ Monocytes isolation
Tween 80Euromedex2002-AMycobacteria culture
Glycerol high purity Euromedex50405-EXMycobacteria culture
 Middlebrook OADC enrichmentBecton-Dickinson211886Mycobacteria culture
7H9Becton-DickinsonW1701PMycobacteria culture
Versene 1xLife Technologies15040033Nonenzymatic cell dissociation solution
DAPILife TechnologiesD1306Nuclei dye
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570Nuclei dye
Syto60Life TechnologiesS11342Nuclei/cytoplasm dye
FormalinSigma-AldrichHT5014Cell fixation solution
siRNA targeting Dectin-1Santa-Cruzsc-63276 
*siGenome* Nontargeted siRNA pool DharmaconD-001206-14 
RifampicinSigma-AldrichR3501antibiotic
Isoniazid (INH)Sigma-AldrichI3377-50Gantibiotic
Hygromycin BLife Technologies10687-010antibiotic
AmikacinSigma-AldrichA1774antibiotic
Automated Confocal Microscope OPERAPerkinElmerImage acquisition
Columbus 2.3.1 Server DatabasePerkinElmerData transfer, storage, and analysis
Acapella 2.6 softwarePerkinElmerImage-based analysis
GraphPad Prism5 softwareGraphPadStatistical analysis
Excel 2010MicrosoftStatistical analysis

参考文献

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