定量检测抗体诱导补体激活的方法对红血细胞

摘要

在这里，我们描述了两个测定法用于测定补体活化诱导的抗红细胞。过电流测定法的主要优点是它们的数量和易于理解的性质。

摘要

对红血细胞（红细胞）的抗体可导致补体激活导致通过补体受体在肝脏中（血管外溶血）或导致红细胞的血管内溶解的加速间隙。同种抗体（ 如 ABO）或自身抗体红细胞抗原（如自身免疫性溶血性贫血，AIHA看出），导致补体激活有潜在危害，可-导致血管内溶解，尤其是当-致命^1。目前，补体激活，由于对红细胞（自动）抗体是通过使用Coombs试验反映了补体沉积于红细胞或由非定量溶血测定反映红细胞裂解^1-4评估体外 。但是，为了评估补体抑制剂的疗效，它是强制性的，具有定量技术。在这里，我们描述了两个这样的技术。首先，检测以检测C3和C4上的沉积是由抗体诱导在患者血清中红细胞是预sented。为此，FACS分析是使用荧光标记的抗-C3或抗-C 4的抗体。接着，定量溶血测定进行说明。在此测定法，补体介导的溶血引起的病人血清的测量是利用分光光度法检测所释放的血红蛋白的。这两个实验都非常重复性和定量，促进抗体诱导补体活化的研究。

引言

对红血细胞（红细胞）的抗体可通过红细胞表达抗原其不存在于接收者的红细胞输血诱发。这些异体抗体可能会由于须待下列输血^5，补充活化严重的急性溶血性输血反应。在自身免疫性溶血性贫血（AIHA），患者有自身抗体对自身红细胞。这导致了细胞通过的IgG结合到红细胞上的脾和/或壳体的自身抗体能够通过补体受体在肝脏^6,7，激活补体的吞噬细胞的Fcγ-受体的相互作用加速间隙。暴发性补体激活导致血管内溶血是罕见的，但往往是致命的。加速，补体介导的红细胞破坏引起的任何异体或自身抗体导致急性贫血，因此潜在的致命性组织缺氧。自动抗体AIHA归类在温暖和寒冷的抗体，dependin在他们结合到红细胞（37°C或更低，分别）的最佳温度克。温暖的抗体是IgG同种型通常和IgM抗体的冷抗体同型^8,9。 AIHA可继发如 lymphoprolyferative疾病，结缔组织疾病，实体肿瘤，感染或药物，但在50％的案件AIHA是特发性^9。

检测丙种球蛋白（ 例如 ，IgG或IgM）和补体结合到病人的红细胞是通过半定量直接抗球蛋白（Coombs）试验（DAT）装置进行的。在DAT患者红细胞温育与抗IgG或抗体C3d。红细胞凝集的现象证明了附加的补体组分或IgG结合的存在。检测异体或在患者的血清中的自身抗体是由间接抗球蛋白试验（IAT）的装置执行。 IAT中，菠萝蛋白酶处理过的试验红细胞温育与病人血清，洗涤，然后用抗-H培养乌曼IgG抗体。的情况下的红细胞已被致敏的抗红细胞抗体存在于病人血清凝集会发生。 IgM抗体对红细胞后的菠萝蛋白酶治疗试验的红细胞与患者血清孵育，将直接导致凝集。红细胞凝集的直接Coombs试验或IAT中或者由眼睛在试管中或通过在一个小Sephadex柱由大小为¹分离凝集和单个红细胞将样品加载在视觉上进行评估。

另一种常用的技术来测量红细胞的补体激活是溶血测定¹中，其中患者血清诱导的菠萝蛋白酶处理的红细胞^10（补体-介导的），溶血的能力进行评估。测试记为阳性时，离心后的上清液染成红色由于释放血红蛋白，并认为，如果它仍然无色为负。无论是抗人球蛋白试验和溶血试验是半定量以来的最高塞鲁米稀释来表示，其中，测试仍然是阳性。

抗球蛋白试验和溶血试验是强大的分析认为在诊断常规使用。因为这些测定是半定量的，依赖于执行它们不适合研究补体活化的红细胞上细微的差别，如在评估补体抑制剂的疗效所需的测定中的技术人员的经验。因此，我们开发了两个定量检测由（自动）抗体，以确定补体激活对红细胞，我们将在本文中介绍。

首先，我们开发了一种测定法来测量补体C3和C4的激活片段对红细胞的沉积（ 图1A）。在该试验中，人的菠萝蛋白酶处理过的0型红细胞温育用热灭活的患者血清（抗红细胞抗体来源），清新AB血清（补体源）和抗C5单克隆抗体（艾库组单抗）。在这个INCubation，会发生C3和C4的沉积，如果病人血清中含有补体激活抗红细胞抗体。为了防止红细胞裂解由下游的补体激活阻断性抗-C5单克隆抗体被加入。接着，C3和C4上的红细胞沉积是通过使用荧光标记的单克隆抗体或Fab片段与C3和C4，分别进行反应的FACS检测。门上的单个红细胞是很重要的，以确保结果的可靠性。这种技术的优点包括所需要的小体积患者材料制成，在级联的早期活化补体被评估，并且该​​方法是可重复的和定量的。看着两个C3和C4的一个附加优点是可以区别的经典和凝集素途径的激活（包括C3和C4沉积）和交替途径激活（只有C3沉积）之间进行。而不是未经处理的红细胞使用菠萝蛋白酶处理的红细胞增加了作为灵敏度说。

第二个分析是基于当前使用的溶血测定（ 图1B）。人类菠萝蛋白酶治疗0型红细胞孵育用热灭活的患者血清（抗红细胞抗体源）和新鲜的AB血清（补源）。如果补体是由患者抗红细胞抗体激活，会出现剂量依赖性红细胞溶解，导致释放出血红蛋白。发布血红蛋白量是通过降低盘片的完整和支离破碎的红细胞后，测量其吸光度在上清液414 nm的量化。吸光度关联与发生溶血的量。相反，目前使用的测定法，该协议允许一个目标，溶血，这是非常可重复的和不依赖于解释该测定中的人的数量值。

这些方法的应用已在^11，在那里可能使用的C1-抑制剂如AIHA补体抑制剂呈S被描述tudied。

研究方案

1。菠萝蛋白酶处理过的红血细胞的制备

1. 洗0类型的红细胞3倍用1×PBS（离心664×g离心2-5分钟）。
2. 孵育1卷袋装RBC与两卷的10分钟0.5％的菠萝蛋白酶溶液在37°C
3. 洗细胞3倍用1×PBS。
4. 该细胞可以被存储为在4℃下在1×PBS中3％的溶液，至少一个星期。

2。 C3和C4沉积分析红细胞用流式细胞仪

1. 通过在56℃下将样品加热30分钟热失活所需的病人血清的量（或其它抗红细胞抗体来源）
2. 在VBG洗菠萝蛋白酶处理的红细胞三次^- （5 mM的佛罗那，150 mM氯化钠，0.05％明胶pH7.4）中重悬在他们VBG ^{+ +（VBG -} + 2毫摩尔MgCl ₂ +的10mM的CaCl _2），得到0.5％的溶液。
3. 吸取以下组件成圆底板中，用玻璃珠（六或适当的混合）：25微升0.5％的红细胞，37.5微升新鲜的AB血清（补源）和37.5μL200μg/ ml的抗C5。抗C5是昂贵的并且可能是很难获得的。人们可以考虑使用C5-/C6-/C7-或C8缺乏血清代替AB血清和抗-C5。
4. 添加每孔患者血清的0.1-33％的终浓度。正确的差异在血清浓度每孔由于使用热灭活的AB血清。加VBG ^{+ +}得到150微升/终体积良好。关闭板与酶联免疫吸附贴膜。
5. 孵育1.5-2小时，在37℃振荡。
6. 用PBS +0.5％BSA（离心664×g离心2分钟）洗涤红细胞3次。
7. 添加荧光标记的抗C3和抗-C 4的单克隆抗体或其Fab片段在PBS +0.5％BSA（减少凝集），以1微克/毫升的最终浓度。这里定制开发的抗-C3-的Alexa Fluor 488和抗-C4的Alexa Fluor 647的单克隆抗体被使用;成分股的选择Ë荧光标记允许同时检测C3和C4的流式细胞仪。
8. 孵育30-45分钟，在室温下轻轻摇动。
9. 洗涤红细胞3次，用PBS +0.5％BSA中。
10. 重悬红细胞150微升的PBS +0.5％BSA和吸取到一个新板（玻璃珠的流式细胞仪分析之前干掉）。
11. 进行FACS分析。独立的单细胞在分散绘图FSC-A双峰，在 ​​单一红细胞设置闸门;选择的荧光信号（ 如 FITC和APC）的相应检测通道。
12. 使用中值荧光强度定量结果。

注意：可以使用同种型对照（ 例如，荧光标记的抗IL6小鼠IgG1）。然而，建议包含一个真阴性对照，例如通过孵育红细胞无患者血清（只有AB血清）或没有补体源（热灭活的AB血清和热灭活患者血清），一ð然后用相同的抗-C3-的Alexa Fluor 488和抗-C4的Alexa Fluor 647抗体染色这些。这给出了比在红血细胞¹²的情况下的同种型对照更有效的控制，尽管这些不同的控件通常给予相同的，负面的结果。

3。定量溶血测定

1. 通过将样品加热30分钟，在56℃下热失活所需的患者的血清的量（或其它抗红细胞抗体来源）
2. 洗涤红细胞3倍与VBG ^-一旦与VBG ^{+ +。}
3. 吸取以下组件成圆底板中，用玻璃珠（对于适当的混合）：35微升3％的红细胞，将25μl新鲜AB血清（补体源）和1〜50％患者血清。正确使用热灭活的AB血清的血清浓度的差异。加VBG ^{+ +}得到150微升/终体积良好。关闭板与酶联免疫吸附贴膜。
4. 在37°C为1.5-2小时，用颤抖。
5. Çentrifuge板在664×g离心5分钟以减少减速（ 例如减速至完全停止在2-3分钟）。
6. 小心吸取90微升上清液在一个新的微孔板。它以防止气泡，并防止带沿完整的细胞是在此步骤中很重要。
7. 在合适的分光光度计测量A414/690。
8. 表达的裂解作为与纯净水的样品的红细胞溶胞的百分比。

结果

图2A显示了一个代表性的散点图红细胞。对于单个红细胞合适的门可以看出，在去FSC-W - FSC-A地块（P1）。通常约95％的红细胞落入本P1栅极（单细胞）内，但是，当患者血清的高百分比被使用时，这可降低到70-80％，特别是当抗红细胞IgM是存在于病人血清。

对C4沉积AIHA患者血清的效果代表性的结果示于图2B和图2C C3沉积。如在这些图中可?...

讨论

上述测定是可再现的和鲁棒性。它们很容易进行，并有可能与许多样品在同一时间（在96孔板中）执行它们。因此，这种方法也将适合于一个完全自动化的系统中， 例如在ELISA机器人系统。相反，目前使用的技术，这些测定是定量的，这将有助于例如在补体抑制剂的作用的研究。此外，该解释是客观的，这是一个改进目前使用的检测。

这两种检测方法有一个关键...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Fresenius Kabi
BSA	Sigma	B-4287
Barbital	Fagron	0261	This chemical is subject to drug regulation.
Sodium Barbital	Fagron	0263	This chemical is subject to drug regulation.
Gelatin	Merck	1.0470.0500
Sodium chloride	Merck	1.06404.1000
Magnesium Chloride	Merck	1.05833.0250
Calcium chloride	Merck	1.0238.0500
Dylight 488 amine reactive dye	Pierce	46402
Dylight 650 amine reactive dye	Pierce	62265
αC5 (Eculizumab)	Alexion Pharmaceuticals
FACS (Canto)	BD		Any FACS can be used that has the appropiate lasers.
Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum)	Thermo Labsystems	1500-193	Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used
BD FACSDiva software v 6.1.2	BD	643629	Any compatible FACS analysis software can be used
Bromelain	Sanquin	K1121