激活和NLRP3炎性活性的人单核细胞来源的树突状细胞用IL-1β测量

摘要

树突状细胞（DC）分泌IL-1β响应于TLR8识别合成嘌呤，R848，接着NLRP3炎性体激活与尼日利亚菌素，因此，IL-1β可以用来测量NLRP3炎性活性。细胞内细胞因子染色法，免疫印迹和ELISA法用于准确地测量通过IL-1β表达NLRP3炎性引发和活化。

摘要

从白细胞介素的分泌素（IL）产生的炎症过程-1家族细胞因子由免疫细胞引起局部或全身炎症反应，组织重塑和修复，以及病毒学控制^1，2。白细胞介素-1β是先天免疫反应的基本要素，并有助于消除侵入的病原体，同时防止建立持续性感染^1-5中。

Inflammasomes是关键信令平台白细胞介素1转化酶（ICE或胱天蛋白酶-1）的激活。在NLRP3炎性需要在DC中的至少两个信号，使IL-1β分泌^6。亲IL-1β蛋白表达在静息细胞限制;因此，一个起动信号所必需的IL-1β的转录和蛋白表达的影响。第二信号中的多蛋白NLRP3炎性体的形成感测由NLRP3结果。树突状细胞，以respon的能力d，来所需的IL-1β分泌的信号可以使用合成嘌呤，R848，这是由TLR8在树突状细胞（moDCs），以素细胞人单核细胞检测到，随后激活NLRP3炎性体与细菌毒素进行试验和钾离子载体，尼日利亚。

单核细胞来源的DC很容易产生文化，并提供比纯化的人骨髓DC显著更多的细胞。这里介绍的方法不同于其他炎性测定法，它使用在体外人，而不是小鼠衍生的DC因此允许在人类疾病和感染的炎性体的研究。

引言

先天免疫系统的活化是必需的感染，疾病，和疫苗接种⁷中引导适应性免疫应答。树突状细胞是最有效的抗原呈递的先天免疫系统的细胞;它们是专门用于摄取抗原，迁移到淋巴结，并激活幼稚CD4 ⁺和细胞毒性CD8 ^{+ T}细胞^8-10。启用快速病原体检测的先天免疫系统利用众多种系编码的模式识别受体（PRR），识别保守的病原体衍生的基序或细胞应激和损伤的宿主衍生的标记。 Toll样受体（TLRs）是膜结合的模式识别受体识别某些胞吞噬病原体相关的分子模式（PAMP）和相关联的危险性分子模式（D-AMPS）。通过样受体（最接近现代种）对比点头是细胞质和的PAMP和阻尼的多元化作出回应。点头样受体重新目前抵御病原体逃避细胞表面和细胞内吞猪蓝耳病的第二行。病原体衍生的，或“危险”的相互作用有关，与TLR和NLR配体因素导致DC成熟而导致与其他免疫细胞和促进T细胞和自然杀伤细胞活化¹¹增加直流互动的状态。

白细胞介素-1β是对感染的宿主防御的重要组成部分。在识别微生物，高促炎性细胞因子，IL-1β，分泌和功能的化学引诱剂和先天免疫和适应性免疫细胞激活剂， 在体内的IL-1β主要是负责对急性期反应包括发热和炎症细胞因子合成^12。

最最接近现代种含有被认为在配体感应，中央核苷酸结合域（NACHT）是IMPO运作一个C端富含亮氨酸重复结构域rtant为NLRP3低​​聚和N末端效应器结构域（PYD在NLRP3），通过蛋白蛋白相互作用介导的信号转导至下游目标。在NLRP3蛋白质定义了最强烈的研究炎性复杂。这种蛋白质是NLR家族的成员，并具有以形成多分子蛋白复合物NLRP3，适配器蛋白PYCARD（也称为ASC）和ICE组成的能力。当炎性激活PYCARD结合NLRP3 N端结构域，并通过caspase活化和募集结构域（CARD）域新兵冰。白细胞介素-1转换酶最初产生为包含CARD的动机在其N-末端的酶原。炎性形成的结果使二ICE分子充分接近诱导其催化活性。炎性复合物是必要的激活ICE从而允许它来转换细胞质亲IL-1β成熟的细胞因子。

白细胞介素的分泌成功-1β在区议会需要检测两个不同的独立危险信号。首先，TLR传感的PAMP，DAMPS，或细胞因子信号传导（TNFα或IL-1β）的导致细胞质亲IL-1β蛋白表达的上调。第二，往往是不同的，信号所必需的炎性复合物的形成ICE成熟的上游。一些炎性刺激信号包括细菌膜孔形成毒素（如尼日利亚菌素），溶酶体破坏晶体（如单钠尿酸盐结晶，密歇根州立大学），和细胞外的ATP。上游机制领先了这些不同的激活剂，以NLRP3炎性体的激活目前还不清楚。调查研究炎性体形成的信令上游建议，细胞内的事件，如感应低钾血症或活性氧（ROS）的间接激活炎性^13-28。

当中的NLRP3炎性体的不同的病毒活化是流感，它提供了bOTH所需的IL-1β分泌^3，29-33初级和次级信号。使用鼠标NLRP3基因敲除模型发现，IL-1β分泌的DC是NLRP3依赖^32。此外，NLRP3基因敲除小鼠引起的白细胞减少感染的部位和有经验的死亡率较高^2，5。最近的两篇论文提出了一种机制，在流感病毒感染NLRP3炎性体的激活;首先，通过识别病毒RNA由TLR7或TLR8（取决于响应细胞的TLR表达）或通过传感共生细菌被其他的TLR诱导细胞质亲IL-1β的表达，随后的第二信号，激活NLRP3的吸反式高尔基网络^33，34上形成炎性由病毒离子通道蛋白M2。在后者的步骤，触发NLRP3炎性体是由细胞内离子的干扰来实现的环境导致ROS的产生，这是简单地说，通过NLPR3感觉到作为一个信号，以形成炎性。不过，ICE活性流感感染过程中炎性激活上游的确切机制仍不清楚。

这个工作描述了一种技术，用于研究NLRP3炎性体在人类moDCs可以用作用于通过一个很好的途径相关的DC基于响应于TLR8结扎IL-1β分泌与R848然后激活炎性体的进一步研究的基础有价值已知的激活NLRP3的，尼日利亚。这种方法的变体可以与其它细胞类型，包括可以使用，但不限于：单核细胞，巨噬细胞，以及其他DC亚群，和上皮细胞。

研究方案

操守准则：研究样本获得并存储与捐助方的同意研究。所有的样品应该被编码或在使用前匿名。此协议遵循我们的机构审查委员会的指导方针。

1，分化人外周血单核细胞的成单核细胞来源的树突状细胞。

注意：人的血沉棕黄层充当人外周血细胞（PBMC）的源极和来自纽约血液中心（纽约，NY）获得。献血者是健康的志愿者。 5日程序与人外周血单核细胞（PBMC）的电镀开始到组织培养瓶^35,36。从公布的协议显着的差异有以下几种：

1. 使用225厘米²非致热性聚苯乙烯组织培养瓶用滤帽共每瓶2×10 ⁸外周血单个核细胞，以坚持，而不是10厘米的聚苯乙烯组织培养板秒（58厘米^2）（步骤1）。
2. 用5％合并的人血清（PHS; 30毫升）中制备介质在500毫升的RPMI-1640 + L-谷氨酰胺，将5ml的1M HEPES缓冲液，并1.4毫升50毫克/毫升庆大霉素（5％PHS介质），然后通过过滤一个20微米的过滤器。加总为50毫升5％小灵通媒体每225厘米²组织培养瓶。
3. 用25毫升新鲜的RPMI-1640洗涤粘附细胞3次。每次洗涤过程中剧烈振荡5秒，吸非贴壁细胞（步骤4）。
4. 添加190微升400单位/微升的IL-4和380微升100 IU /μl的烧瓶中（步骤3）的GM-CSF在第0天，2，和4。第0天定义为天的PBMC进行初始镀步骤1（步骤8）。
5. 收获天5 moDCs在1×10 ⁶个细胞/ ml（步骤15）的浓度。
6. 立即在他们休息的状态下使用moDCs。步骤17-22永远不会执行。注：样品应为获得最佳效果，尽快收集后进行处理。
7. 分装moDCs在浓度2×10 ⁵个细胞化/孔（200微升1×10 ⁶个细胞/ ml /孔）在96孔圆底平板（免疫印迹，ELISA，FACS），或者添加到聚-L-赖氨酸处理过的chamberslide（显微镜）进行实验。注：至少有4个条件：完全无刺激（阴性对照），吸只，其次是激活只有激活和预充。条件可以扩展，如果需要，包括为R848和稀释剂对照尼日利亚菌素。如果下游分析是ICS的，重复是必要的同型对照。

2，灌注炎性 - 信号1

1. 根据制造商的说明重组的冻干R848在DMSO中。稀释股票的工作在室温下用RPMI-1640。
2. 加R848以最终浓度10μM至适当的孔中18小时。和地点的细胞在培养箱中在37℃，5％CO _2。

3激活NLRP3炎性体 - 信号2

1. 根据制造商的说明重组的冻干尼日利亚菌素乙醇。添加到适当的条件之前，稀释作业储备，在室温下用RPMI-1640。
2. 添加尼日利亚菌素以20μM的终浓度，并返回到培养箱中在37℃和5％CO ₂的6小时。吸之间，并在激活过程中无洗涤步骤进行。注：IL-1β的分泌增加了钙离子载体的存在下，布雷菲德菌素A，莫能菌素，二硝基苯酚，或羰基氰化氯苯^37,38。因此，除了这些分泌抑制剂，不推荐在分析促发炎性或活动，因为它会改变IL-1β的分泌。

4，IL-1ß样品采集

1. 与细胞和上清液于974×g离心3分钟离心板。
2. 而不会干扰细胞沉淀，吸出上清液，并转移到为eparate一轮以从上清液测定细胞因子的分泌见底板。注：上清液可暂时储存在-20℃或-80℃下长期贮存。
3. 用200μl的1×PBS中于974×g离心3分钟，洗涤细胞小球3次，以从蜂窝样品除去任何外IL-1β。注意：当洗涤从96孔板中的细胞沉淀，通过迅速板倒置取出洗净入收集箱，以便不干扰样品。

5，测量IL-1ß从细胞和上清液样品

1. 细胞内细胞因子染色（ICS）：该ICS协议进行说明^39，40。注意：不要悬细胞，如果下游分析是显微镜。所有洗涤和愿望应不干扰细胞层/丸粒（取决于下游测定）来进行。
   1. 加入100μl的5％小灵通介质插入相应的孔中。加合适的体积（约^{1μl/2x105个}细胞，或1微升/孔）的荧光标记的α-CD11c的和α-CD14（表型标志物;克隆B-LY6和MφP9，分别）或同种型对照对细胞进行10分钟，在RT在黑暗中。
   2. 用1×PBS进行3分钟洗三次，在974×g离心。
   3. 通过加入100μl的4％PFA中于室温在黑暗中20分钟，固定细胞。
   4. 暂停点：用100微升的1×PBS以974×g离心3分钟，储存于4°CO / N在1x PBS洗。
   5. 加入100微升的透化缓冲液对细胞进行30分钟。注意：透化缓冲液组成的1×PBS中与0.3％的Triton X-100和1％牛血清白蛋白（BSA）为透化。请勿打扰贴壁细胞时，下游的测定是显微镜。
   6. 添加α-IL-1β-FITC的适当体积（约62纳克antibody/2x10 ^5个细胞，约2.5或100μl/孔）（克隆8516）或同种型对照2小时在恒温箱中在37℃下
   7. 用200μl的透化缓冲液在974×g下在黑暗中3分钟，洗涤细胞3次。
   8. 可选：染色用DAPI，加封固，并轻轻放置盖玻片的载玻片上。让封固治愈O / N捕获显微图像前。
   9. 收购流式细胞仪或显微镜的数据。注：同型每个条件比较时用流式细胞仪或显微镜分析适当的染色。
      1. 场向电流：获取一个样本的时间。分析的MoDC人口亲IL-1β染色前细胞^-在活细胞中，随后选通上的CD11c ⁺ CD14设置FSC / SSC门。
      2. 显微镜：用染色阳性样品设定曝光时间 - R848处理。用DAPI ⁺亲^IL-1β+和DAPI ⁺亲IL-1β ^-确定亲IL-1β+表达moDCs百分比。
2. SDS-页：免疫印迹法进行检测亲IL-1β。注意：下面介绍的技术标准相结合免疫印迹法，梯度4-20％聚丙烯酰胺凝胶，和荧光或化学发光检测^41，42。
   1. 裂解细胞中直接加入10μl变性裂解缓冲液（5μl的β-mercaptoethanol/950微升Laemmli样品缓冲液，然后用细胞裂解缓冲液稀释1:1）。裂解物转移至1.5ml离心管中。
   2. 基于干板10分钟，在100℃下热裂解液
   3. 旋裂解物在20,800×g离心对minicentrifuge 1分钟，以浓缩液体积。暂停点：样品可以在-20℃下冷冻于短期存储。
   4. 加载的总体积到聚丙烯酰胺凝胶上。运行140伏至约1小时，或在凝胶盒直至染料前沿跑出凝胶的底部。
   5. 从聚丙烯酰胺凝胶转移蛋白到PVDF的Immobilon-FL membrANE为90分钟，在100 V块，用5％BSA的膜在Tris缓冲盐水/ 0.1％吐温20（TBS-T）1小时。注：PVDF的Immobilon-FL是最适合用荧光检测使用。用不同的组合物的膜，被推荐用于其它检测技术，以增加信号背景比。
   6. 淡化第一和第二抗体在10毫升5％的BSA / TBS-T的。在4°CO / N对一抗孵育一阵晃动和第二抗体在室温下1小时，同时晃动。
   7. 用TBS-T洗膜3次，每次5分钟，而抗和二抗孵育，再二次孵化与成像之间晃动。注：可以使用荧光或化学发光检测被检测波段。按照制造商的检测说明。
3. ELISA法：被冷冻储存样品需要分析前平衡至室温。降速样品在离心机巩固上清冷凝通报BULLETIN。按照制造商的指示，对IL-1β的测量。注：在本协议中IL-1β是专门测量;然而，TNFα，IL-6，和免疫调节细胞因子IL-10的同时测量确保适当的条件进行底涂。

结果

这些技术测量TLR8与R848吸。细胞内细胞因子染色亲IL-1β允许从CD14显微镜和场向电流读数^-的CD11c ⁺ moDCs。这两种技术都可以相对于定量给底漆的非，或休息，电池控制以及同种型对照（ 图1和2）。亲^IL-1β+染色细胞的百分比乘以这一人群的几何平均，以提供平均荧光强度（MFI）。所述MFI为可比亲IL-1β存在于阳性染色的细胞的量。

免疫印迹措施...

讨论

炎性细胞因子是一体的操纵先天和适应性免疫反应对抗病毒感染。分泌IL-1β已经证明流感病毒感染^3，43，44中增加。由这些细胞因子响应于识别病毒在人树突状细胞加工的精确机制尚不完全清楚。骨髓DC分离试剂盒是昂贵和费时的。分离试剂盒和足总杯的排序可能会无意间应力或激活细胞。此外，还有经常分离的细胞用于实验的量不足。 在体外培养 ^45，46人原髓细胞DC的还好...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
IL-4	R&D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine	Cellgro	10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells	New York Blood Center		PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12 well tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3516
96 well round bottom tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R&D	IC201F
FITC isotype control	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β-Tubulin	Santa Cruz	SC-9014
α-IL-1β	R&D	mab201
PVDF Immobilon-FL membrane	Millipore	IPFL00010
gradient 4-12% polycrylamide gel	Bio Rad	161-1159
Laemmli sample buffer	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30% solution sterile/filtered
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710	16% solution
Human inflammatory cytokine bead array kit	BD	551811
Nigericin	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M Corp.
α-CD14	BD	340436
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			On site stock room
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs	Thermo Scientific	159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units	Thermo Scientific	569-0020
HEPES	Invitrogen	15630080
Goat α-mouse IRDye 800CW	Licor	926-32210
Donkey α-rabbit IRDye 680RD	Licor	926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder	Thermo Scientific	26634
Tris Glycine SDS 10x	Bio Rad	1610732
Tris Glycine 10x	Bio Rad	161-0734
Methanol - 4 L	Fisher Scientific	A433P-4
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide	BD Falcon	354108
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707