三维文化：一种工具来研究正常腺泡结构与恶性转化的乳腺细胞

摘要

对重组基底膜乳腺上皮细胞的三维培养是扼要重述在体内的体系结构的良性乳房，并从良性乳腺表型分化的恶性表型的有效方法。重要的是，该系统可以应用到研究浸润性癌中的其他组织中。

摘要

乳腺浸润性癌是一组恶性上皮性​​肿瘤特征的侵袭邻近组织，并倾向转移的。信号癌细胞和微环境之间的相互作用发挥对乳腺癌的生长和生物学行为¹强大的影响力。然而，大多数来自细胞外基质，这些信号的丢失或当细胞生长在二维培养（2D）作为单层的相关性被充分研究。近年来，三维（3D）上的重组基底膜培养已成为首选的方法扼要重述良性和恶性乳腺细胞的组织结构。在三维培养的细胞保留来自细胞外基质的重要线索，并提供一个生理相关的体外系统^2,3。值得注意的是，有越来越多的证据表明细胞有不同的行为时，在3D种植相比，2D ^4。三维培养可以有效地使用，以从良性乳腺表型分化的恶性表型的装置和用于支撑的细胞和分子信号传导参与^3。一种良性上皮细胞的显着特点是它们被极化，使得根尖细胞质是朝向管腔和基底细胞质搁置在基底膜。这apico - 基底极性消失在乳腺浸润性癌，其特点是细胞解体和形成网状和分支小管是随意渗入周围的基质。良性腺体和浸润癌之间的这些病理的差异可以被复制在3D ^6,7。使用了适当的读奏像单轮腺泡结构的定量，或差的验证分子标记物的细胞增殖，极性和凋亡与其它分子和细胞生物学技术，三维文化视角组合表达E能提供更好的理解过程中的恶性转化，并划定了负责信号的细胞变化的重要工具。

引言

三维上重建基底膜乳腺上皮细胞培养物（三维）是一种重要的模型系统来研究复杂的表型和正常乳腺和乳腺癌^2,3的相应的信令。乳房的功能单元是终末导管小叶单元（TDLU），它由一个小导管，其分支成腺泡。腺泡是高度组织的结构中，两个层细胞，上皮细胞和肌上皮细胞，这是由基底膜⁵包围的组成。正常的腺泡的最显着特征是细胞极化，附着在底层基底膜和专门的细胞与细胞的接触。这个复杂的组织被破坏的浸润性癌。被广泛使用的二维培养，其中细胞生长为单层，不允许腺泡的形成。因此，该单层培养缺乏提供一个系统来捕捉上皮细胞之间的错综复杂的关系在正常乳腺和乳腺癌放松管制。乳腺癌细胞的功能性的单种培养上皮已经开发了几个实验室^2,3。三维培养涉及乳腺癌细胞在基质胶，这是从Engelbreth-的Holm-群小鼠肉瘤细胞衍生的溶解提取物，并且是可商购的生长。我也喜欢用其他的胶原基质的3D。乳腺细胞可以通过3D嵌入式测定法，其中细胞培养嵌在基质胶²中培养在三维。此外，细胞可以通过3D顶部化验培养，也被称为3D叠加分析，这是符合成本效益，因为它需要的基质胶量较小，并促进集落形成时间推移监测相衬成像，是理想的原位成像^{2 -3。}在上面试验中的三维已将用于定义腺泡表型和基因表达概况⁷之间的相关性。

三维培养可effectiv伊利用于从浸润癌区分正常和良性细胞。正常和良性乳腺细胞形成生长停止极化结构，在中心一个明确的管腔上，而基底膜浸润性癌细胞生长力强和随意，没有结算管腔。 E6/E7永生化人乳腺上皮细胞和MCF10A细胞系，这是一个自发永生化细胞系来自一个36岁的患者，纤维囊性变孤立的，已成功地用于夺回乳腺良性表型3D ^3,8，并担任一个模型系统来研究几个分子^8,9的致癌和抑癌功能。这些良性细胞可以被工程化以引入慢病毒/逆转录病毒操纵感兴趣的基因（次）。如果感兴趣的基因（s）是一种肿瘤抑制基因，shRNA的介导的敲除会导致，而恶性转化，如果感兴趣的基因是良性细胞癌基因的过度表达应该表现出恶性表型。在这两种情况下形成的三维腺泡结构可以捕获恶变。

良性的单细胞接种于3D开始增生并形成圆球形结构。 5-8天的细胞这个球形集合体将分化为细胞的周围偏振层，其与所述基质胶接触，并减少极化的细胞，缺乏与基质胶接触的内质。在接下来的10-15天的内细胞将开始凋亡形成一个清晰的管腔死。恶性肿瘤细胞将增长胡乱失去极性。高度恶性细胞通常形成分支结构。这些差异在表型可以通过时间的推移相衬成像和原位与相关分子标记免疫染色被捕获。最常用的标记是α-6-整，基底极性的标记，与所述增殖标志物磷酸化组蛋白3和apoptot组合IC标记物裂解的caspase-3。后者是重要的，以确定是否有管腔形成在中央的腺泡，正常和良性乳腺细胞的特征。其他极性和细胞间接触标志物包括GM130，层粘连蛋白，企业风险管理，E-cadherin的。交替的乳腺癌细胞系可被工程化来操纵感兴趣的基因。在这种情况下，复归到一个更大的增长被捕良性的表型可以被用作一个读出从癌症的表型区分。

三维培养也可以仔细用来划定参与恶性转化^10-11的信号通路。使用上面提到的读数，药理抑制剂，阻断性抗体或重组蛋白可用于在分子信号传导，导致恶变被精确定位。与来自不同实验室的不断努力，可以从三维提取细胞，提取RNA，并制备裂解物用于免疫印迹和免疫noprecipitation。这些策略在协议中，并逐步详细地描述。

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研究方案

材料1。制备及文化传媒

1. 解冻生长因子降低（GFR）的基底膜，在4°CO / N。
2. 热身完整的媒体所需的细胞系在37°C。 MCF10A-ATCC指定的介质; HME-Ham氏F-12培养基补充有5％胎牛血清，1微克/毫升氢化可的松，5微克/毫升的胰岛素，10毫微克/毫升的表皮生长因子，和100纳克/毫升的霍乱毒素; SUM149-Ham氏F-12介质补充有5％FBS，2微克/毫升氢化可的松和5微克/毫升胰岛素;和MDA-MB-231-10％FBS-DMEM中
3. 预冷冰上的8孔腔滑。
4. 准备组织培养罩和用品。

2，三以及8商会幻灯片立体养殖

1. 外套各孔在8孔滑动用40微升的GFR基质胶的。添加基质胶中的幻灯片的中心，然后用P200移液管尖端传播。尽量分散尽可能均匀，避免气泡和过扩展可导致半月板形成。
2. 孵育的幻灯片，在37℃5％CO ₂条件下。而基质胶的固化，胰蛋白酶消化细胞，收集并在组织培养中的离心旋转，在150×g离心4分钟。
3. 计数细胞并稀释至12,500个细胞/ ml在相应细胞系的完整的媒体。加GFR的Matrigel至2％，并添加400微升到基质胶预涂腔滑动的各孔中。
4. 孵化中的CO ₂培养箱的幻灯片。给新鲜完整的媒体的变化，每4 ^个天，直到15天。
5. 治疗药物抑制剂：对于抑制剂的研究添加小分子抑制剂的完整的媒体在电镀后辅以抑制剂新鲜媒体的变化的时候，每三天，而生长在基质胶的GFR的细胞。
6. 治疗用纯化的蛋白：
   1. 板上的细胞以下步骤2.1-2.3。让文化来生长4天，随后血清starvati上16小时。
   2. 在第5天，治疗的细胞与纯化的蛋白质的适当的浓度在0.1％FBS补充培养基中的血清饥饿的细胞。术后第2天给予新鲜的媒体变化与纯化蛋白质。
   3. 在10日与完整的HME介质更换条件培养基。让文化成长为另外5天。
7. 生长在基质胶腺泡结构的免疫荧光染色：
   1. 制备2％多聚甲醛，0.5％的Triton X-100和100mM甘氨酸中的1×PBS，pH为7.4。制备免疫缓冲液（IF缓冲液），其包含的1×PBS中含有0.1％牛血清白蛋白，0.2％的Triton X-100，0.05％Tween-20的。
   2. 使用P200的枪头小心吸的条件培养基。
   3. 修复腺泡结构，用2％在室温（RT）新鲜制备的多聚甲醛固定20分钟。
   4. 透化的细胞用0.5％Triton X-100的10分钟，在4℃下
   5. 洗净文化三大次100mM甘氨酸，10〜15分钟，每次洗涤。
   6. 在中频缓冲器10％山羊血清，称为主块，1小时，在室温下阻断细胞。
   7. 孵育用20微克/毫升的山羊抗小鼠的_F（ab'）2片段在30分钟主块缓冲器中的培养物。这个步骤是重要的，以阻止免疫小鼠IgG种类在基质胶。
   8. 与一抗孵育第二封闭液（小学块20μg/ ml的羊抗鼠的F（ab'）2片段）O / N在4°C。
   9. 与中频缓冲器为每一个温和的摇摆10-15分钟，洗三次。
   10. 孵育45分钟，在中频缓冲器荧光标记的二抗。
   11. 洗3次，每次10 min与中频缓冲器与温和的摇摆。
   12. 安装滑轨含DAPI以可视化的核防褪色剂。
   13. 让片干燥O / N在室温。
   14. 图像采集：采集共聚焦图像的殖民地英里dsection生长在基质胶的顶部细胞。欲了解更多信息，取得了一系列的光学部分整个被Z堆叠腺泡结构的整个长度。

3，三维立体培养中2井室幻灯片的免疫印迹

1. 预冷冰2井室幻灯片。按照步骤2.1-2.4扩大试剂为2孔腔滑如大衣，160微升基底膜，并添加1.6毫升细胞/基质胶混合到2孔滑动的每一个孔。
2. 收获的基质胶使用市售的三维培养细胞收集试剂盒，按照制造商的说明腺泡结构。
3. 稀释细胞清洗和细胞收集缓冲区为1x和预冷至4℃。洗涤基质胶和撞出应进行冰上。
4. 洗腺泡结构3X使用的细胞洗涤缓冲液。
5. 用细胞收集BU收集腺泡到15ml离心管中FFER随后孵育30分钟上的摇杆在4℃下混合悬浮液以及用1毫升移液管。这将破坏基质胶中的小块，并释放大部分细胞在细胞收获缓冲液中。
6. 颗粒细胞在200 XG在文化离心机。从沉淀的细胞用P200移液管尖取出水凝胶的漂浮层。
7. 重悬随试剂盒提供在SDS样品缓冲液中裂解。的RIPA裂解缓冲液中也可使用。

恶性与良性乳腺表现型4。定量

1. 以下步骤2.1-2.4生长的细胞以一式三份对各治疗组。
2. 采取腺泡结构的相位对比图像从每个孔在5X或使用连接到滑动移位器和一个计算机相衬显微镜10X分辨率。从一帧幻灯片移动到另一个，从而覆盖腔滑动的整个井所拍摄的图像。
3. 计数腺泡结构的总数，单轮平腺泡和multiacinar结构或缺乏组织胡乱成长结构的数量以及与分支过程从它发出的数量。
4. 计算单轮平腺泡结构与恶性结构的比例和情节的柱状图。通过学生t-检验计算显着性。

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结果

三维培养物可被有效地用于区分人类乳腺上皮细胞的恶性表型的良性乳腺。镀在基质胶单良性细胞成长为有组织的球形结构采用X射线相衬成像，可以很容易地成像为单轮平腺泡在一个平面上。镀在基质胶的单一的恶性细胞生长随意，显示出非常高的折射率，而且难以像在一个平面上。 如图1，良性HME和MCF10A细胞形成球形寻找腺泡而高转移性乳腺癌细胞系SUM149和MDA-MB-231成长为分支的管?...

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讨论

在这里，我们已经描述了乳腺上皮细胞对重组基底膜的三维立体培养和本系统恶性与良性乳腺表现型来区分的用处。此系统还可以用于从其他腺体组织培养不同类型的细胞和已报道已被成功地用于培养的前列腺上皮细胞，支气管上皮细胞和甲状腺上皮细胞，仅举几例^12-14。三维培养的重要性在于，它是生理学相关的模型。三维培养提供了深入了解，导致腺体结构破坏的恶性转化过程中的分...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth Factor Reduced Matrigel	BD Biosciences	354230	Avoid repeat freeze thaw
Lab-Tek glass hamber slides 8-well	Thermo Fisher Scientific	177402	Precool on ice
Lab-Tek glass chamber slides 2-well	Thermo Fisher Scientific	177380	Precool on ice
Goat anti mouse F(ab´)2 fragment	Jackson Immunoresearch	115-006-006
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121
Fluorescent conjugated Alexa antibodies	Molecular Probes		Please look at molecular probes website
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Molecular Probes	P36935
3D Culture Cell Harvesting kit	Trevigen	3448-020-k
Anti-Apha-6-integrin	Fisher Scientific	MAB1378	1:100 dilution for IF
Anti-GM130	BD Biosciences	610822	1:100 dilution for IF
Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated	Fisher Scientific	16-222	1:100 dilution for IF
Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175)	Cell Signaling	9661s	1:50 dilution for IF
Anti-E-cadherin	BD Biosciences	610181	1:200 dilution for IF