糖肽捕获的细胞表面蛋白组学

摘要

细胞表面蛋白的生物学上重要的和广泛的糖基化。我们在这里介绍一个糖肽捕获的方法来溶解，丰富，并且这些去糖基化蛋白质浅显的LC-MS基础的蛋白质组学分析。

摘要

细胞表面蛋白，包括胞外基质蛋白，参与所有主要的细胞过程和功能，例如生长，分化和增殖。这些蛋白质的综合表征为生物标志物的发现，细胞类型识别和药物靶点的选择，以及帮助推动我们的细胞生物学和生理学的了解丰富的信息。表面蛋白，然而，构成，因为它们固有的低丰度，高疏水性，并且重的翻译后修饰显著分析挑战。采取上表面蛋白的糖基化常见的优点，我们在这里介绍一种高通量糖肽捕获方法，集成的现有的几种N-glycoproteomics装置的优点。我们的方法可以丰富从表面的蛋白质所产生的糖肽，并删除其聚糖，使用LC-MS浅显的蛋白质组学研究。该解决N-glycoproteome包括INFormation蛋白质的身份和数量，以及糖基化他们的网站。此方法已被应用到了一系列的研究领域，包括癌症，神经干细胞，和药物毒性。该方法的局限性在于表面的膜蛋白，这样，需要相对大量的样品进行该分析相比，研究集中于胞质蛋白的丰度低。

引言

细胞表面蛋白与细胞外环境进行交互并从外部中继信号到细胞的内部。因此，这些蛋白，包括细胞外基质蛋白，在细胞生物学和生理学不等的增殖，生长，迁移，分化老化等各方面发挥关键作用。表面蛋白的功能通过与其他细胞，蛋白质和小分子^1-3交互。细胞表面蛋白的分子特性是极大的兴趣不仅为生物学家也为制药公司，药品60％以上是针对细胞表面蛋白^4。

串联质谱（MS），以其卓越的灵敏度，准确度和吞吐量鉴定蛋白质和多肽，一直是一个强大的工具，用于全球蛋白质组学研究^5,6。然而，表面的蛋白质会对质谱为基础的蛋白质组学显著挑战，在低量的重金属修改存在最表面的蛋白质。表面蛋白的跨膜区呈现它们的疏水性;这是特别适用于多通道的跨膜蛋白的情况。因此，这是难以溶解在水溶液中的膜蛋白无洗涤剂的帮助;然而清洁剂的使用普遍抑制高效液相色谱法和质谱^1,7,8的蛋白质鉴定的表现。因此，膜蛋白已被鉴定中直接LC-MS基于蛋白质组学很差。

糖基化是发生在细胞表面蛋白⁹的最重要和最丰富的翻译后修饰之一。聚糖的巨大复杂性和异质性阻碍肽'MS信号^10。然而，一些蛋白质组的方法已经使用这个唯一的修改，以丰富的表面蛋白，并从之前的LC-MS分析的蛋白质除去糖部分。这些方法s包括凝集素亲和捕获¹¹和酰肼基或硼酸基化学捕获¹²以及亲水性色谱分离^8,13。聚糖的去除转化膜蛋白常规的蛋白质，并大幅简化了MS表征。因为糖基化还发生在分泌蛋白具有高的溶解度在对比膜蛋白，许多glycoproteomic方法对可溶性蛋白进行了优化，并趋向于具有较低的糖肽的选择性和时被部署到膜蛋白^8,14灵敏度。其他的方法也存在丰富，尤其细胞表面蛋白，例如那些使用超速离心¹⁵和标记策略^16。表征膜蛋白我们的方法和现有的其他方法之间的详细比较了最近进行的^17，结果表明，我们的方法可以执行同样出色，如果不是更好，比所有被比较的膜蛋白质组的方法，但具有更高的简易性。

为了帮助研究人员使用这种方法，我们这里详细的一般协议。这种方法综合了现有的glycoproteomics战略几个优点，特别适用于膜糖蛋白构想，但该方法同样适用于分泌蛋白。该方法的特征包括：1）膜蛋白的完全溶解，2）糖肽的糖蛋白，而不是使用固体摄像基板时，以消除潜在的空间位阻的富集，3）使用酰肼化学组成之间的共价键糖肽和捕集基板上，使得键合的糖肽可以容忍严格洗涤的高glycoselectivity，和4）的能力，以对整个捕获过程中一个管用于减少样品损失和缩短操作时间。实施这一方法来研究一个变量后，生物样品包括细胞和组织的ETY，我们观察到的高选择性（> 90％），以糖蛋白^8,17,18。

研究方案

1，嘉实膜

1. 添加低渗缓冲液（10mM的Tris-HCl，10mM的氯化钾，1.5毫摩尔MgCl _2，pH 8.0）中与蛋白酶抑制剂混合物到细胞沉淀（〜10 ⁸个细胞），并培育在冰上15-30分钟。裂解细胞通过使样品通过注射器针头（5-10遍），或通过一个Dounce匀浆（15-30冲程）破碎样品。使用血细胞计数器和台盼蓝染色来检查裂解的效率。
2. 由裂解物的差速离心获得的微粒体部分在3000 GX 15分钟，然后在100,000 GX 2小时。第一离心分离得到的颗粒，它是细胞核部分，以及上清液的离心分离后产生一个第二沉淀，它是一个包含质膜以及膜结合细胞器⁸的微粒体部分。最后的上层清液是胞质部分。存储的微粒体部分在-80℃冷冻进一步analys是如下所示。

2，溶解，变性和精华膜蛋白

1. 溶解的微粒体部分中的变性缓冲液（40毫摩尔Tris，10mM的EDTA，10mM的TCEP，0.5％品RapiGest，pH8）中，然后孵育溶液，在100℃持续10分钟。
2. 冷却该溶液加热至室温，加入超高纯度尿素粉末在溶液中，以800万的最终浓度和孵育的样品在37℃下30分钟。
3. 添加碘乙酰胺储备溶液至样品以15mM的终浓度，并孵育在黑暗中的溶液30分钟，在室温下烷基化的游离硫醇的样品中。添加的DTT储液的样品，以10 mM的终浓度，并孵育另外10分钟，将溶液在室温下以淬灭过量的碘乙酰胺。
4. 稀释所得到的溶液用10倍的40mM Tris缓冲液在pH为8，并随后添加胰蛋白酶到样品以1:20的比例trypsi的n到总蛋白。保持在37℃的烘箱中过夜消化反应，以确保反应完成。
5. 通过酸化样品溶液至pH为1，用HCl，这种情况也发生故障的洗涤剂， 即品RapiGest终止消化。降解品RapiGest在37℃下反应1小时，并通过离心分离除去沉淀开发。
6. 清洗包含样品的肽通过C-18固相萃取（SPE）柱并通过Speed​​Vac中干燥所得到的样品上清液。
7. 之前和胰蛋白酶消化，以确认消化效率后执行样本的SDS-PAGE分析。

3，糖肽捕获

1. 溶解于偶联缓冲液（100mM乙酸钠，pH 5.5）清洗过的肽。添加高碘酸钠成在10mM的最终浓度为在黑暗中30分钟，在室温下将肽溶液。这会氧化的糖链的顺式二醇基团为醛，这让聚糖对夫妇通过酰肼化学树脂。由亚硫酸钠淬灭过量的高碘酸盐在20mM的最终浓度和pH为5，在室温下10分钟。
2. 引入肼衍生的树脂成以1:4（树脂溶液），以一对糖肽与树脂的比率的肽溶液。在37℃下与终端到终端的旋转完全偶合反应1-2天。
3. 通过用1ml以下各项的洗涤树脂两次去除未结合的肽：去离子水，1.5 M氯化钠，甲醇和80％乙腈。最后，用1ml 100mM的NH ₄ HCO ₃洗涤树脂3次，在pH 8至系统的缓冲液交换，以100mM的NH ₄ HCO _3。
   1. 收集上清液和洗涤的未结合的肽（可选）的分析。
4. 从PNG酶F IN孵育过夜树脂释放的N-糖肽在37℃与N END到终端的旋转。通过离心和80％乙腈洗收集释放肽。干燥所得到的在Speed​​Vac中用于LC-MS分析溶液。

4，进一步分馏（可选）

为了进一步简化样品的复杂性，分馏所得到的N-糖肽。例如，重新溶解干燥的肽为10毫米氨甲酸，pH值3用20％乙腈和使用强阳离子交换（SCX）色谱分级分离肽。干燥所得到的洗脱液，然后用反相LC-MS ^8,17,18分析所得到的肽组分。

5，清洁释放的N-糖肽（可选）

如果关注上升为肽的潜在污染，再溶解干燥的肽为含0.1％甲酸，并使用一个MCX SPE柱，以进一步清洁肽前反相LC-MS分析。

的说明：数据库搜索参数。

中的N-糖肽脱树脂的选择性裂解，PNG酶F中的N-聚糖连接的天冬酰胺转换为天冬氨酸。因此，解放区的N-糖肽的0.9840大质量转变。准确地识别这些肽，这种修改需要被添加到搜索参数一起共同修饰如蛋氨酸，半胱氨酸和氧化carbamidomethylation。

结果

在实验过程中的代表性流程图总结在图1的标签，并进一步分馏步骤是可选的，细节将在近期公布¹⁸描述。另一种方法是分析未修饰的肽，其不与树脂反应。分析所述未修饰的肽的优点包括：非糖基化的肽类和蛋白质，例如在紧密连接claudins的电位标识;一个附加的优点是更准确的定量。基于这些优势，我们称之为这种方法 g lycocapture - 一个ssisted-G的叶形q uantitative...

讨论

在这里，我们介绍一种糖肽捕获策略分析细胞表面蛋白。可以应用该方法来研究分泌蛋白，如血液中，以及在其他体液或细胞培养基中。

该方法的成功依赖于样本的完全消化;因此，消化效率的SDS-PAGE鉴定是必要的，尤其是对于样品的第一次分析。一个完整的消化可具有挑战性的膜蛋白，并可以仅在膜级分的彻底的溶解是可能的。当洗涤剂引入增溶过程开始和尿素的孵育后结?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma	646547
Iodoacetamide	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Sodium periodate	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Hz hydrazide gel	Bio-Rad	153-6047
Trypsin	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 cartridge	Waters	WAT054955
Oasis MCX cartridge	Waters	186000252
Protease inhibitor coctail	Sigma	P8340
Urea	Amersco	568
Sodium sulphite	Caledon	8360-1
Invertase	Sigma	I0408
α-1 trypsin	Sigma	F2006
Ribonulease B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Ovalbumin	Sigma	A5503
Conalbumin	Sigma	C0755