使用α-银环蛇毒素结合位点标记来研究GABA A受体膜定位和贩运

摘要

在这里，我们展示了使用荧光染料的Alexa耦合到α-银环蛇毒素测定GABA A受体表面的定位和内吞作用的海马神经元。通过采用轴承结构结合α-银环蛇毒素，可以实现质膜蛋白的内吞贩运分析短外标签。

摘要

这是越来越明显的神经递质受体，包括离子型GABA A受体（GABAAR），表现出高度动态的贩运和细胞表面的流动性^1-7。为了研究受体细胞表面的定位和内吞作用，这里所描述的技术结合使用荧光​​α-银环蛇毒素与细胞表达含有α-银环蛇毒素（BGT）结合位点（BBS）的结构。在BBS（WRYYESSLEPYPD）是基于肌肉烟碱乙酰胆碱受体，其结合BGT以高亲和力^8,9的α亚基。注册成立的BBS站点允许表面定位和受体插入或移除与应用外源性荧光BGT的测量，如以前在GABAA和GABAB代谢的跟踪受体^2,10描述。除了 ​​信息的网站，我们氨基酸4与5的成熟GABAAR亚单位通过标准米之间插入一个pH敏感的绿色荧光蛋白（pHGFP ^11）olecular生物学和PCR克隆策略（参见图^1）12。 BBS的是3'的pH值敏感的GFP报告，由13个氨基酸丙氨酸/脯氨酸接头隔开。对贩运这一出版物是基于固定样本中描述的研究中，pHGFP作为总的记者标记GABAAR亚单位蛋白水平，使BGT正常化标记受体的人口占总人口的受体。这最大限度地减少细胞与细胞的标记GABAAR亚基的较高或较低的基线表达所得BGT染色信号的变异性。此外，pHGFP标签可方便识别构建表达细胞的活的或固定成像实验。

引言

利用荧光再加α-银环蛇毒素研究受体定 ​​位和动态是率先在烟碱乙酰胆碱受体^13-15，毒素的内源靶的研究。随后，最小BGT结合肽（BBS）的掺入已被用于研究贩卖既兴奋性和抑制性配体门控离子通道和G蛋白偶联受体^2,10,16-21的。本次论坛为基础的技术提供的优势，用于贩运研究，如表面生物素的方法，活细胞的抗体标记的抗体与细胞外抗原表位，和光漂白（FRAP）后荧光恢复其他方法。在细胞表面生物素游离胺的共价修饰，以影响细胞活性的潜力。基于抗体的研究常常受到阻碍表面抗原簇或封盖，它可以改变拐卖事件。由于对FRAP S中的漂白步骤tudies，一个重要的问题是损害底层的细胞结构。一个额外的优点是，信息标记的构建体也可用于生化方法学与生物素偶联银环蛇毒素对驴受体贩卖。这种技术是很容易适用于细胞系和原代细胞。对于在细胞表达烟碱乙酰胆碱（胆碱）受体的使用，胆碱受体拮抗剂筒箭毒碱，必须使用整个协议所指示的。对未转染的细胞在缺乏筒箭毒碱的执行一个简单的表面BGT标签（等同于内吞协议T = 0的时间点），将提供内源性胆碱受体的证据。

使用这种技术的一个重要的考虑因素是BBS的适当的插入，使得它存在于当目的蛋白被递送到质膜的细胞外的位置。例如，GABAAR亚基的N-末端结构域T​​RAF期间驻留在囊泡腔ficking并成为细胞外质膜受体插入后，使细胞表面的受体和其从细胞表面通过内吞事件去除的评估特异性标记。之前我们已经表明，除了GFP，myc和或BBS的表位GABAAR亚基这个领域在功能上保持沉默。标准控件应该执行，以确保标签的蛋白的表达水平相似，以不加标记的构建物，它适当地本地化的，并且它不影响受体的功能。转结构的这一特点也将有助于在故障排除过度担忧。

研究方案

下面描述的所有协议都是按照IACUC和匹兹堡大学医学院的内部评级机构审查委员会。

1。海马神经细胞在组织培养罩的准备

注意：使用无菌技术和试剂整个协议1。

1. 制备聚-D-赖氨酸（0.1 mg / ml的H ₂ O）涂覆的玻璃盖玻片上作为底物的神经元的培养。
   1. 将每个3.5厘米组织培养皿内4-5圆形玻璃盖玻片。
   2. 点70微升聚-D-赖氨酸到每个12毫米盖玻片。注：对于实时成像，玻璃底3.5厘米组织培养皿可以使用（现货200微升聚-D-赖氨酸上的嵌入式14毫米玻璃盖玻片）。
   3. 离开烹制的菜肴在组织培养罩的O / N。为了尽量减少聚-D-赖氨酸蒸发，并保持表面消毒的组织文化引擎盖，关闭窗扇和关闭日ê鼓风机的O / N。注：O / N孵化期间不使用紫外线灯。
   4. 第二天早上，洗碗3倍用2毫升H ₂ O
   5. 删除最后一个H _{2 O}的洗涤后，加入2毫升媒体到每个3.5厘米菜，菜品留在孵化器，直到准备板的神经元在步骤1.4。
2. 海马神经元从胚胎18-19天（E18-19）大鼠（从²²戈斯林修改）编制。
3. 转染新鲜分离的神经元在培养的一天1-4微克maxiprepped结构的DNA。
   注意：通常为3的DNA微克转染到1-2万神经元，用50％的生存力和60％的转染效率（ 例如，开始与2000000的神经元：（（2×10 ^6个神经元×0.5）0.6）提供了约100万神经元;。故障排除潜在的问题，当其中600,000转染¹不同量的结构的DNA可转过度表达，其次是结构定位和功能的相应特性。
4. 镀上以每3.5厘米菜约200,000神经元的最终密度的聚-D-赖氨酸包被的盖玻片的转染的神经元。注：为玻璃底培养皿，板40,000-50,000神经元上14毫米的玻璃区域。
5. 更换培养基制备神经元培养后4-24小时，然后让神经元发展的孵化器，直到在体外 （DIV）或所需的阶段14-17天。

2。内吞作用分析

注意：注意对α-银环蛇毒素和废物筒箭毒碱和处理：

1. 处理所有肽神经毒素的建议的生物安全2级（BL-2）研究方案的指导方针。所有适当的个人防护装备必须佩戴。冻干粉剂毒素应根据制造商的说明进行配制。毒素废物的寿LD在遵守监管机构的环境，健康与安全准则处置。
2. 以去除可能在储存期间形成的潜在的肽聚集体，α-银环蛇毒素的等分试样应简要使用前离心，并将上清液应该用于实验。
3. α-银环蛇毒素（BGT）股票是在-20℃下再悬浮至1毫克/毫升的浓度在无菌H ₂ O和存储于10μl等分试样荧光再加BGT股票是用在3微克/毫升。筒箭毒碱的用量为150μM的最终浓度。

1. 设置台式加热块到16℃，在寒冷的房间，薄铝或不锈钢板之上。或者，如果有的话，一个台式冷却/加热设备可用于每个步骤需要16℃。
2. 含有以mM凉爽外的Hepes缓冲盐溶液（HBS：135氯化钠，氯化钾4.7，10 HEPES，11葡萄糖，1.2的MgCl _2，和2.5_氯化钙 ，pH值7.4），以16℃的水浴中。
3. 传递神经元菜铝板在16℃，冷却5分钟。
4. 移除媒体（ 保留条件培养基和储备孵化器的步骤2.8，测定细胞内吞作用的时间点 ）和替换用1毫升16°C HBS +筒箭毒碱（150微米）2分钟。
5. 删除HBS +筒箭毒碱，以标签的废弃物容器，并更换1毫升16°C HBS +筒箭毒碱（150微米），+α-银环蛇毒素的Alexa 594 [3微克/毫升]，孵育在16°C下15分钟。
6. 删除HBS +筒箭毒碱+α-银环蛇毒素的Alexa 594，以标签的废弃物容器和洗碗3倍用2毫升16°C哈佛商学院（洗涤液可以通过在抽吸含有50ml 50％的漂白粉的保温瓶收集）。
7. 对于实时成像时间序列实验用玻璃下面受体的内吞作用见底3.5厘米培养皿中，执行步骤2.1-2.6，然后转移到菜加热阶段（珀耳帖元件）上的显微镜，并开始成像共聚焦或全内反射荧光显微镜的设置。
8. 转让T = 0的时间点盖玻片到RT 4％多聚甲醛/ 4％蔗糖20分钟的菜，与其他盖玻片继续步骤2.9。
9. 对于其他的时间点，与哈佛商学院的更换平衡调节37℃介质（保留在步骤2.4），并在37°C 注回到孵化器内吞作用：建议对T = 15额外的时间点，30，和60。
10. 在时间点需要，采取菜肴从培养箱中，用2毫升RT的DPBS洗涤两次快速（DPBS无钙，镁），然后在4％低聚甲醛/ 4％蔗糖20分钟固定。
11. 20分钟后固定，除去4％多聚甲醛/ 4％蔗糖浪费容器，用2ml RT DPBS洗两次菜。
12. 孵育盖玻片在RT中免疫块溶液10分钟（块溶液= 5％马血清，0.5％BSA的DPBS），含0.2％的Triton X-100对渗透率IZE的神经元，使细胞内的受体池和/或其他感兴趣的蛋白标记的抗GFP免疫染色。
13. 删除块+ 0.2％的Triton X-100和孵化的免疫块解决方案无需盖玻片的Triton X-100为20-30分钟。
14. 在4℃下进行块盖玻片一抗孵育在室温或O / N数小时注：与盖玻片初选在4℃的CO / N孵化常规生产改善免疫荧光结果。
15. 洗盖玻片3X用DPBS（5分钟，每次洗涤步骤）。
16. 孵育盖玻片，在1小时在室温块溶液的第二抗体。
17. 洗盖玻片3X用DPBS（5分钟，每次洗涤步骤）。
18. 摩盖玻片，单独搬运每个盖玻片：从盖玻片与实验室组织的去除背部多余的液体，然后倒置盖玻片到4微升玻片上安装介质。
19. 允许片干燥在室温覆盖30分钟，然后ST在4℃的矿石，直到准备进行显微镜检查。
20. 图像采集和实验，共聚焦显微镜（盲目的实验条件）进行分析。 60X油NA以下激光器1.49浸泡的目的：氩气488纳米，561二极管，640二极管。
    1. 使用相同的图像获取的设置，取得与该神经元的细胞体和在焦点几个树枝状突起单个Z截面图像。
    2. 沿20μm的每神经元3-4近端树突量化α-银环蛇毒素的Alexa荧光信号和GFP免疫染色，使用相同的阈值对所有的内吞作用的数据进行分析。
    3. 对于每个时间点分析从10-12神经元数据时，重复该实验与几个独立的神经元培养物。

结果

一个信息标记构建体的表征，包括重要的控制，如确定所表达的蛋白质正确装配（特别是与受体的多个亚基组成），贩卖到细胞表面，并适当地局部化。抑制性突触是由γ-氨基丁酸的共定位该具有抑制支架蛋白gephyrin并结合在突触前的抑制端子，确定囊泡抑制性氨基酸转运加载GABA和甘氨酸进入突触小泡（VIAAT / VGAT）A受体表面的集群。 如图2顷 α2pHGFP+ BBS表达神经元与表面GABAAR标记BGT，...

讨论

此处所描述的信息为基础的固定和活的技术可以被用来跟踪受体或其它细胞质膜蛋白质运输中的细胞系，神经元和其它的原代细胞。此法已成功地用于研究膜的插入和移除的配体门控离子通道和G蛋白偶联受体，并评估变化贩卖由于受体激动剂和调节剂的存在下进行。主要方面包括标签的适当定位到细胞外的位置，并进行控制，以确保增加的BBS（作为标准的其他记者，如GFP）在功能上是沉默的。对...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
P3 Primary Cell 4D kit	Lonza	V4XP-3024
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate	Molecular Probes	B35450
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate	Molecular Probes	B13422
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probes	B13423
(+)-Tubocurarine chloride	Tocris	2820
Mounting medium	DAKO	cS703
DPBS no calcium, magnesium	Invitrogen	14190-136
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
Gephyrin antibody	Synaptic Systems	147 011	1:300
VIAAT/VGAT antibody	Synaptic Systems	131 002	1:1,000
anti GFP	Life Technologies	A6455	1:2,000
Glass bottom tissue culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes
Coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm	Warner Instruments	640-0702