捕获复合质谱 - 一个强大的工具来确定新型C-二GMP效应蛋白

摘要

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

摘要

在对第二信使C-二GMP的参与合成（diguanylate环化酶）和降解（磷酸二酯酶）酶的鉴定和表征过去的十年里已经取得了长足的进步。与此相反，小的信息是可用的关于分子机制和细胞成分通过此信号传导分子调节的细胞过程的一个不同的范围。大多数已知的效应蛋白属于Pilz家族或正在退化diguanylate环化酶和磷酸二酯酶已经放弃了催化作用，并已采取效应功能。因此，为了在大范围细菌的实验方法是必需的，以确定和验证的量可靠，在硅片预测失败新颖效应的更好地确定蜂窝的c-二叔GMP的网络。

我们最近开发出一种新型的复合捕获质谱（CCMS）基于技术作为一个强大的工具，生化识别和描述的c-二GMP结合蛋白。这种技术先前已经报道为适用于广泛范围的生物体^1。在这里，我们给大家利用来探测这样的信号成分的协议的详细说明。作为一个例子，我们使用绿脓杆菌 ，一种条件致病菌其中c二叔GMP起着毒力和生物膜控制的关键作用。 CCMS确定的c二叔GMP的网络的已知或预测的部件的74％（38/51）。这项研究详细解释了CCMS程序，并建立它作为一个强大和灵活的工具，以查明参与小分子信号的新组件。

引言

C-二叔GMP的是所使用的大多数细菌，以控制它们的生长和行为的各种方面的关键的第二信使。例如，C-二叔GMP的调节细胞周期进程，迁移和胞外多糖和表面粘附^2-4的表达。通过这样的过程的协调的c-二叔GMP的促进生物膜的形成，这是与一个范围病原菌⁵的慢性感染相关的处理。 C-二GMP是由酶称为diguanylate环化酶（DGCS）窝藏催化GGDEF域⁴合成出。一些DGCS具有抑制网站在C-二GMP绑定下调的环化酶活性。 C-二叔GMP的降解是由两个不同的类磷酸二酯酶（PDE）窝藏或者催化EAL或HD-GYP域^6,7催化。

大部分已知的效应蛋白的直接结合的c-二叔GMP仅属于三类蛋白之一：催化盟友不活跃GGDEF或EAL域和域皮尔磁，即发生在C-二GMP结合⁸的构象变化小的分子开关。 DGCS，偏微分方程和皮尔磁蛋白很好的特点和他们的域可以相对安全地预测，在硅片 。特别感兴趣，现在专注于新型的C-二GMP效应的鉴定。一些C二叔GMP的效应具有不同结合基序被描述最近诸如CRP / FNR蛋白家族Bcam1349在伯克霍尔德新洋葱伯克霍尔德杆菌或P的转录调节FLEQ 铜绿假单胞菌 ^9,10。此外，C-二叔GMP特异性核糖开关最近确定和示出，以控制基因表达的c二叔GMP依赖性^11。不同效应的c二叔GMP的结合基序仅很差保守制造这种蛋白质的生物信息学预测困难。为了解决这个问题，我们开发了一种生物化学方法，它是基于使用一个C二叔GMP的SPE的cific捕捉化合物结合质谱^1,12,13。

我们最近设计了一种新的三价的c-二叔GMP的捕捉化合物（CDG-CC中， 图^1）1。这种化学物质的支架的组成如下：1）一个用作诱饵捕获的c-二叔GMP的结合蛋白的c-二叔GMP的部分，2）紫外线光活化反应性基团用于交联所述CDG-CC的结合的蛋白质和3）生物素分离使用链霉亲和包被的磁珠捕获的蛋白质。在CDG-CC可用于直接和特异性从大分子作为细胞裂解物的复杂混合物捕获的c-二叔GMP的效应。捕获复合基和化学基蛋白质组学方法先前已报道为适用于广泛范围的生物， 例如柄杆菌新月 ， 沙门鼠伤寒和P.铜绿假单胞菌 ^1,14。

在这种方法的论文，我们提供了一个使用P的提取CCMS程序的深入介绍假单胞菌作为一个例子。本研究建立CCMS作为一个强大和灵活的工具，生化鉴定涉及小分子信号的新组件。

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研究方案

1.准备裂解液

1. 成长P.假单胞菌细胞在LB到所需的外径。
   注：对于指导：使用日志阶段文化≈百毫升文化/样品固定相的文化和≈500毫升文化性/样品（OD _600nm的 = 0.5）。
2. 粒料通过离心20分钟，在5000×g 下。
3. 重悬0.5-1克颗粒在1ml裂解缓冲液（6.7毫MES，6.7毫米的HEPES，200mM的氯化钠，6.7毫醋酸钾，滴滴涕1毫米，pH值7.5）中，并添加蛋白酶抑制剂（完全迷你型，无EDTA），以及作为DNA酶I。
4. 裂解的细胞3次传代通过法式压力室，在20,000磅（见材料清单）。
5. 超离心细胞裂解物以100,000×g的1小时，在4℃。
6. 保存上清液（转到步骤2）。
7. 通过上下吹打洗涤用1ml 1X裂解缓冲液沉淀。
8. 超速离心机以100,000×g的1小时，在4℃。
9. 闪存冻结颗粒在液氮并储存在-20℃直至用于膜蛋白（参见步骤3）的捕获。

2.去除免费的C-二GMP和其他核苷酸（可溶部分专用）

1. 用10ml冷的裂解缓冲液的洗PD10脱盐柱（见材料清单）。
2. 倾上清（≈1ml）中到PD10以去除核苷酸。
3. 洗脱用4ml冷的裂解缓冲液（500微升步）。
4. 选择最集中的分数由Bradford法确定的，集中他们。

3.颗粒再悬浮和增溶（膜部分只）

1. 重悬在500〜1000微升1×捕获缓冲液（无清洁剂）的粒料（ 见表1）。
   注：沉淀很难重悬。它应先移液器上下用吸管大致重悬沉淀，然后使用注射器27 G以良好均匀的溶液。
2. 添加1％（重量/体积）N-十二烷基β-D-麦芽糖苷（DDM）。
3. 孵育在4℃下至少2小时（或O / N）上的旋转轮。
4. 超速离心机以100,000×g的1小时，在4℃。
5. 收获上清液。

4.蛋白质浓度测量

1. 测量通过Bradford测定法对蛋白浓度（用BCA测定法对膜级分）。
2. 设定总蛋白浓度为10毫克/毫升。

5.捕获

1. 混合300微克蛋白质用1mM的GDP，GTP，ATP，CTP和20微升的5×捕获缓冲液（100mM HEPES，250mM的醋酸钾，50mM的MgAc，5％甘油，pH为7.5）（ 表1）。调节反应体积为100微升用H ₂ O.
   注：总体积包括CDG-CC和c二- GMP的情况下的竞争的控制的体积（见步骤5.3和表2）。
   注：所有实验均在200执行＃181; 12升管的PCR条带（Thermo Scientific）进行。
   注：对于膜部分，确保始终保持高于临界胶束浓度（0.01％重量/体积），直到在8M尿素的蛋白质溶解步骤（步骤7.1）的DDM浓度。
2. 孵育在4℃下进行30分钟，在旋转轮。
3. 添加10μM的CDG-CC（最终浓度）。
   注：包括但CDG-CC的控制（称为“胎圈”控制），并补充有1mM的C-二叔GMP（“竞赛”控制）的控制（ 见表2）。
   注：CDG-CC的浓度可为1至10微米的调整。
4. 孵育在4℃下至少2小时（O / N对膜级分）在一个旋转轮，在黑暗中。
5. 经过短暂的自旋，交联通过激活CDG-CC的用UV光的反应性部分的4分钟，使用CaproBox（见材料清单，λ= 310纳米，辐照度≥10毫瓦/平方厘米，从源的距离= 2厘米）。注意：删除之前条交联的盖子。
6. 加入25微升5倍的洗涤液（5 M氯化钠，250毫米的Tris，pH值7.5）和50微升的再悬浮以及链霉亲和磁珠，轻轻摇匀。
7. 孵育在4℃下1小时在旋转轮。

6.洗涤步骤

注：（磁铁：见材料清单）。开始与捕获的在PCR条盖在磁性珠，与磁铁。然后，通过一个新的含有下一洗涤溶液更换的PCR带。取下磁铁和重悬珠，孵育2分钟。降速和新盖更换盖子。

1. 洗涤步骤（可溶部分只）
   1. 在200μl1×洗涤缓冲液洗涤6次。
   2. 在200微升HPLC级H ₂ O.洗一次
   3. 在200μl80％乙腈洗6次。
   4. 洗2次在200μlHPLC级H ₂ O
2. 洗涤步骤（membraNE分数只）
   1. 在200μl1×洗涤缓冲液+ 0.1％DDM洗5次。
   2. 在200μl1×洗涤缓冲液+ 0.05％DDM洗2次。
   3. 在200微升1×洗涤液+ 0.025％DDM洗一次。
   4. 在200微升1×洗涤液+ 0.0125％DDM洗一次。
   5. 在200μl的100mM的ABC洗3次（碳酸氢铵NH ₄ CO _3）+ 2M尿素。

7. MS样品制备

1. 悬浮珠粒（直接在盖）在20μl100mM的ABC（100毫ABC + 8M尿素的膜级分）并转入1.5毫升管中。
2. 膜部分只：孵育在60℃下5分钟，振摇在500rpm。
3. 加入0.5微升的200mM TCEP（三（2-羧乙基）膦）和孵育在60℃下1小时，摇动以500rpm。冷却至25℃。
4. 加入0.5微升新鲜烹制的400毫米碘乙酰胺和孵化在25℃，30分钟，一个晃动吨500转，在黑暗中。
5. 加入0.5微升0.5 M N -乙酰基半胱氨酸和孵育在25℃下进行10分钟，振摇在500rpm。
6. 膜组分只有：加1微升赖氨酸-C，37°C，O / N。
7. 加入2微克胰蛋白酶和孵化O / N在37°C，震动在500转（包在封口膜，以防止干燥）。
   注：样品可以储存在-20℃下，在这个阶段。
   注意：膜只能部分：增加100毫米ABC此外胰蛋白酶前调整尿素浓度<2M的。
8. 简要降速管和收集珠磁铁。
9. 转移上清液到新的1.5毫升管（重复此步骤，如果小珠留）。
10. 添加5微升5％的TFA（三氟乙酸）+1微升2 M盐酸（15微升5％的TFA + 5微升的2M HCl中的膜部分）。
11. 条件的C18 MicroSpin列（巢组，MA，USA）用150微升的乙腈（旋涂20秒，在2400转）。
12. 球菌保持平衡的C18柱2次用150微升0.1％TFA（自旋20秒，2400转）。
13. 加载样品和自旋2分钟，2000转。
14. 重载流通到柱并重复纺丝步骤（2分钟，2000转）。
15. 洗3次，用150微升0.1％的TFA，5％乙腈（20秒，2400转）。
16. 取一个新的试管中，并用150微升0.1％TFA洗脱两次，50％乙腈（2分钟，2000转）。
17. 干燥的肽在Speed​​-Vac中。
18. 重悬在40微升98％的H ₂ O，2％乙腈，0.15％甲酸。
19. 超声处理20秒（脉冲周期0.5，幅度100％;见材料清单）和自旋向下5秒，12000转（台式离心机）。旋涡10秒，降速5秒，12000转。转移在HPLC小瓶用于LC-MS / MS分析。
20. 冷冻在-20℃。
    注：样品可以储存在-20℃下，在这个阶段。

8. LC-MS / MS分析

1. 运行纳米LC（纳米LC系统）equipp编带型RP-HPLC柱（75微米×37厘米）填充有C18的树脂（魔术C18 AQ 3微米），使用线性梯度从95％溶剂A（0.15％甲酸，2％乙腈）和5％溶剂B（ 98％乙腈，0.15％甲酸）至35％溶剂B在60分钟内以0.2微升/分钟的流速。
2. 分析用LC-MS / MS（双重压力LTQ-的Orbitrap Velos的质谱仪，连接到电喷雾离子源）的肽。
   注意：数据采集模式被设置以获得1个高分辨率的MS质谱仪中的FT部在60,000 FWHM的分辨率随后的MS / MS扫描中的20个最激烈的离子的线性离子阱扫描。以增加的MS / MS尝试的效率，充电状态的筛选工作方式被启用以排除未分配和单独充电的离子。勾结诱导解离被触发时，前体超过100离子计数。动态排除持续时间为30秒。离子累积时间设定为300毫秒（MS）和50毫秒（MS / MS）。

9.数据库搜索

1. 下载P.铜绿假单胞菌 NCBI数据库通过NCBI主页（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ）。
2. 转换使用MassMatrix转换工具（MS原谱成吉祥物通用文件（MGF） http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ）。
3. 使用MASCOT 2.3版本对P.搜索此MGF文件假单胞菌 NCBI数据库含有正向和反向诱饵蛋白的条目。
4. 赖氨酸和精氨酸（除非其次是脯氨酸）容忍2错过了完全胰蛋白酶肽分裂后执行在硅片胰蛋白酶消化。
5. 设置数据库的搜索参数，使氧化蛋氨酸（15.99491大）为变量修改和半胱氨酸残基固定修改carboxyamidomethylation（57.021464大）。对于MASCOT我们搜索荷兰国际集团的高分辨率扫描，设置的前体质量耐受至15ppm，并设置碎片质量公差到0.6沓。最后，设置蛋白FDR至1％。
6. 进口P.的吉祥物搜索绿脓杆菌 CCMS实验到脚手架（Proteomesoftware，第3版），设置参数，以获得蛋白质FDR接近1％，并提取总光谱计数。
7. 为代表性结果呈现在本文中，我们使用了配对T检验的实验与竞争控制比较，并只考虑命中低于0.1 的 p值，和上述2（实验光谱计数/竞争控制光谱的光谱计数比计数）。
8. 数据可在任何电子表格软件进行进一步的分析来导出。

10.无标签定量

1. 导入原始文件到Progenesis LC-MS软件（非线性动力学，4.0版）。
2. 执行LC-MS校准和特征检测的默认settiNGS。
3. 从Progenesis LC-MS导出MGF格式的数据。
4. 使用搜索对NCBI P.吉祥物的MS / MS谱含有正向和反向诱饵蛋白条目假单胞菌数据库。
5. 导入数据库搜索结果转换成Progenesis LC-MS和映射的肽鉴定到MS1特征。
6. 对于数据评估（显着性水平计算，折换率）SafeQuant的ProteinSQAnalysis脚本使用（阈值：低于0.1的Q值，高于2谱计数率）。

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结果

为了找出P.新颖C-二GMP效应铜绿假单胞菌 ，我们系统地使用CCMS分析P.的可溶性和膜组分从对数期培养假单胞菌菌株PAO1（OD ₆₀₀ = 0.5）。在这里，我们总结和讨论这个摸底的代表性结果。四个独立的生物复制品被使用。对于每个实验两个不同CDG-CC的浓度使用（5微米和10微米）。探测特异性，进行了实验，在1mM的C-二叔GMP作为竞争，最后在存在或不存在，用珠对照（

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讨论

特别应注意，在几个步骤的协议。蛋白质浓度是用10毫克的浓度的关键参数/ ml的暂时难以达到当细胞在特定的生长条件（ 例如生物膜或小菌落变体）生长。因此，将沉淀再悬浮应在裂解缓冲液的低体积来进行。蛋白质浓度可以降低到8毫克/毫升。相比由Nesper 等人的 ¹公开的方法中，我们加入不同的核苷酸的捕获反应，以尽量减少核苷酸结合蛋白的非特异性捕获。虽然在加入?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
caproBox	caprotec bioanalytics	1-5010-001 (220 V)	UV lamps coupled to a cooling 96-plate cooling block, for the photoactivation
caproMag	caprotec bioanalytics	included in the CCMS Starter Kit	For easy handling of magnetic particles without pipetting
c-di-GMP caproKit	caprotec bioanalytics	upon request	The kit contains the c-di-GMP-capture compound, c-di-GMP (for the competition control), streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and washing buffer
Disposable PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17-0851-01
12-tube PCR strips	Thermo Scientific	AB-1114
UIS250v sonicator with VialTweeter	Hielscher ultrasound technology	UIS250v and VialTweeter
Miniature French Pressure Cell	Thermo Electron Corporation	FA-003