谁是谁？非侵入性的方法，以个别性和马克晚成小鸡

摘要

该协议提供了一套便捷的方法，使极为快速，简便，无创，可靠，成本低，分子性别鉴定鸟类和它们的无创，快速，安全，易于辨认孵化后不久标记。仅限雏鸡的处理是必需的。的方法，这种方便的工具箱完全符合RRR-指引。

摘要

许多实验需要及早确定后代的性别以及早期新生儿标记为个人的认可。根据动物福利指导方针​​，非侵入性技术，应首选（倘适用）。在我们的团队，我们工作在不同的曲种鸟类在实验室和现场，而我们成功地应用非侵入性的方法，以性别和单独标记小鸡。本文提出了一种综合性的非侵入性的工具盒。绝育鸟类之前第二性性状的表达需要DNA的轴承材料用于PCR的集合。我们通过提取来自口腔拭子DNA建立了一个快速简便的方法对任何年龄（孵化后）的性鸟类。结果可以在3小时内获得。对于个别标志着小鸡羽绒羽毛被修剪的具体模式允许孵化秩序内快速识别。这套方法是简单地适用于配备标准实验室和特别适合干活在该领域，因为没有专用设备克所需的采样和存储。处理雏鸡的最小化和标记和性别鉴定技术是无创性，从而支持动物福利指导方针​​的存款准备金率原则。

引言

个体识别，性别鉴定和基因分型是在各种实验研究的基本先决条件。获得的DNA轴承材料和标识对象明确（即使在早期的年龄）应该有生理，行为和生存的影响微乎其微。只要有可能，侵入性操作应根据存款准备金率原则¹是可以避免的。

非侵入性的方法不仅有利于动物，但也可能会提高所获得的数据作为动物较少受到处理。

在鸟类中，DNA绝育可以对一些非侵入性地获得的材料如粪便^2，羽毛^3,4或口腔拭子^3,5,9进行。无论拍摄对象的状况和年龄口腔拭子是禽流性别鉴定方法的选择，因为它们很容易进行，很少不和处理是短暂的。

到目前为止，从口腔拭子DNA用市售试剂盒^3,6或耗时标准的DNA提取方案^3,6-8中任一萃取。工具包不仅是相当昂贵的，但他们的协议可以并处挑战野外作业。一些程序细节， 如干燥和样品的培养，是不实际的领域。特别是在实验方案需要性取决于治疗从早在几分钟后的阴影的设定，有督促进行快速，非侵入性，可靠和容易的方法得到的结果。

在整个禽流类群相当工具箱标志着个人已经发展^10。可用技术的广泛约占各种研究目标，物种和预算。然而，标志着小雏鸟已面临研究人员更多的挑战。在一些物种（ 如燕雀）雏鸟太小，适用腿带和需要替代方法，这不改变亲子行为。由于意识和改善动物福利和实地和实验室研究技术的兴趣不断增长，使用非侵入性技术被大力鼓励和首选。

该协议提供了一种非侵入性，快速，易于辨认和持久的方法运用腿带之前，单独标记非常年轻的雏鸟是可行的。此标记方法介绍了一个最重要的禽流感的实验室模型的物种，斑胸草雀（Taeniopygia弄蝶 ^）11-13。该协议符合所有的个人标记技术对¹⁰先前公布的目标，并已经被成功地应用于^14,15。

研究方案

所有的程序均符合动物保护（TierSchG）德国法律执行。

试剂和消耗品的1。准备

1. 准备在分子级水5％（W / W）CHELEX-100的解决方案。准备200μl，以标准的1.5毫升的反应管等分。由于CHELEX树脂沉淀快起停牌，有必要重新同质化的不断暂停等分试样的制备过程中。这是可取的制备50毫升或多个在一个批次中，并保持该悬浮液用磁力搅拌器均质化。该CHELEX溶液可保存几年在环境条件下。
2. 切的Whatman滤纸片，其宽度比鸟要测试的喙宽度小。纸张的长度取决于该方法采取该示例：
   1. 使用镊子，将片应该足够长，以使样品收集而不被插入到鸟喙的钳子。作为粗略估计，为0.5厘米的长喙一张纸用1厘米的长度应该罚款。
   2. 如果不使用镊子，这块一定要长，但片的刚度还是应该让上皮细胞取样。
3. 制备PCR预混物的一个等份对每个样品进行分析。对于PCR中的25的总体积微升的混合物含有0.18毫的dNTPs，2毫摩尔MgCl _2，70 mM的Tris-盐酸，17.25毫硫酸铵，0.1％吐温-20，0.32μMP2引物（TCTGCATCGCTAAATCCTTT），0.32μMP8底漆^{（CTCCCAAGGATGAGRAAYTG）16}和2个单位的Taq聚合酶。自制Taq聚合酶¹⁷都可以使用。以允许另外的DNA的溶液的最大量的，6微升预混物可以制备并储存于-20℃下几个星期。

2，样品采集

戴手套是不是鸟类性别决定的PCR引物不能退火到人类的DNA是必不可少的。为其它基因分型的目的可能是可取的。

1. 捕获感兴趣的鸟，轻轻地握在一只手如用'铃声的抓地力^'18。请务必不要挤鸟。
2. 持有一张Whatman滤纸用钳子和刷几次穿过颊，舌片和后鼻孔的内侧。一般样品少于30秒内获得的。
   1. 成年动物：根据种类的不同，可能很难拿到鸟来打开它的嘴。平时接触喙的侧面和应用温和的压力会奏效。
   2. 雏鸟：从刚孵化的雏鸟或采样是特别容易使用这种技术，因为他们的乞讨行为提供了方便地访问到嘴的内部。它甚至有可能得到的样品没有处理它们，因为它们很容易乞求例如 ，当他们的巢箱被打开。
3. 紧随纸张存放在一个准备好的反应管里包含宁200微升的5％（W / W）CHELEX-100溶液。

如果您还打算/需要标记的小鸡，现在这样做是在第6节。

3，储存样本的DNA提取前

1. 如果在实验室工作，店内样品于-20°C。如果这是不可能的或困难的（ 例如，在现场）店内样品在环境温度下。
2. 样品可在温度范围从室温到-20℃下存放3年以上

4，DNA的提取

1. 如果样品被冻结，解冻它在室温下。
2. 确保纸是在浸没在CHELEX-100溶液的试管底部。
3. 孵育样品15分钟，在56℃下
4. 短暂涡旋后短暂离心管的内容。
5. 孵育样品为8分钟，在100℃下
6. 旋转样品以15,000 xg离心3分钟。
7. 使用supernatant为后续的基因分型。

5。分子性别鉴定

1. 准备一台PCR管，每样6微升预混料加为负（强制性）和阳性对照（可选）两个额外的管子。对于常规的性别决定包括从最后一次成功的绝育作为阳性对照样品。
2. 从提取DNA加19微升上清到PCR预混物。确保从溶液的表面到吸管以避免CHELEX珠残留。这是至关重要的，因为CHELEX是阳离子交换，从而严重地抑制所有的酶促反应。
3. 运行以下的PCR程序：培养在94℃，3分钟，每45个循环，30秒熔化工序94℃，接着是30秒的退火步骤，在55℃，接着在72℃45秒延伸步骤C.在最后的追关闭步骤中，反应在72℃下温育5分钟
4. 准备一个2％的标准TBE或TAE琼胶本身凝胶来分离PCR产物。
5. 运行适当的电压设置的琼脂糖凝胶。
6. 可视化的乐队在紫外光下，拍摄一张照片。确保从始发女性样本中的两个频段是完全分离。
7. 由一个（男）或两个（女）乐队的存在从女性样本区分男性。

6。标记雏鸟

1. 检查巢刚孵出的小鸡按计划适当的品种/学习（ 如日常检查，在早晨被告知因为大多数小鸡孵化即可）。
2. 剪下每个鸡的羽毛巢内的不同特征的位置。在斑胸草雀起伏塔夫茨增长跨越雏鸟的身体（ 图4A）四个特征和不同的领域。为每个小鸡切一个区域（ 图4B）。如果有在一个巢四个以上的小鸡，独特的4'发型'可以组合使用。

ove_content“>对斑胸草雀：适用腿带十天后孵化，当羽毛变得很难检测和雏鸟尺寸允许振铃。

结果

口腔拭子可以用来提取DNA进行性别鉴定中的各种小鸟的

，加那利群岛（Serinus加那利岛 ），孟加拉雀（ 白腰文鸟芨 ），南丁格尔（ 红点megarhynchos），大山雀（ 大山雀 ）和黑鹂（ 鸫 -样品采自斑胸草雀（5年Taeniopygia雀，99个人，年龄零天）收集merula）（所有其他物种：样本大小1-3，年龄不详）（ 图1）。

讨论

使用CHELEX口腔拭子性别鉴定表现出非常高的成功率。切割幼体羽绒羽毛启用雏鸟之间的差异，直到腿带是可能的。

从口腔拭子CHELEX-DNA的提取产生足够的DNA，成功地进行分子性别鉴定。性别决定是100％正确的，因为验证的性别二态性的羽毛。这里报道的成功率明显高于报道的前两个研究^7,9率较高。该DNA提取与CHELEX最大限度地减少它的原料可能会丢失移液和沉淀步骤。?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman 3MM Chromatography paper	e.g. Fisher Scientific	No.:3030-153
Chelex 100 Resin	Biorad	#143-2832
Taq polymerase	addgene	http://www.addgene.org/25712/
leg band (Flexi number rings for birds, diameter 2.5 mm)	Horst Stengel Sohn