在体外的方法来观察派生病人和人内皮细胞前列腺循环肿瘤细胞之间的E-选择素介导的相互作用

摘要

我们的报告描述了一种独特的方法来可视化和分析生理流动条件下，在前列腺癌CTC / EC相互作用。

摘要

转移是一个过程，其中肿瘤细胞从原发肿瘤intravasate血液血管和淋巴系统散出，从而接触到外渗形成一个次级定位。肿瘤细胞从血液中血管系统的渗漏可以通过从不同的细胞系获得的内皮细胞（EC）和肿瘤细胞进行研究。最初的研究是使用静态条件下进行，但也得到了很好的记载，内皮细胞的生理流动条件下表现不同。因此，不同的流动腔室组件当前被用于研究内皮细胞与癌细胞相互作用。电流流室组件使用提供了在不同的剪切应力条件下两种不同的细胞系或液体可重复的结果。然而，观察和研究稀有细胞如循环肿瘤细胞（CTCs的）的相互作用，还需要一定的变化作出常规的流室组件。车辆检验中心是在数以百万的血细胞的罕见细胞群。其结果是，难以得到的CTC的纯群体。使用目前富集或耗损技术的CTC的污染与不同类型的细胞中循环通常存在是不可避免的。在本报告中，我们描述了一种独特的方法，以荧光标记的循环前列腺癌细胞，并研究在自组装的流动腔室系统它们与内皮细胞的相互作用。这种技术还可以进一步应用到观察前列腺的CTC和任何感兴趣的蛋白质之间的相互作用。

引言

转移是一个复杂的多步骤的过程，仍然知之甚少。该E-selectin/selectin配体轴已被证明通过促 ​​进血管内皮细胞和癌细胞^1,2之间主要粘附相互作用在肿瘤转移中发挥重要作用。内皮（E）-选择素是由活化的内皮细胞上表达的跨膜蛋白，而不同的E-选择素配体（s）是由肿瘤细胞表达^3。许多体外方法已被成功地应用到模型的肿瘤细胞和内皮细胞之间E-selectin/selectin配体相互作用^{（ECS）1。}为了研究这些相互作​​用，不同的流室系统被用来模拟血液血管系统。之间流动室组件，平行平板流动腔室（PPFC）与内皮细胞一起被常规用作体外模型模拟体内剪切应力条件。在这种方法，内皮细胞生长在35毫米培养皿，并实现了单层后，内皮细胞附着到PPFC和剪切应力为基础的实验中进行。

然而，PPFC和其它现有系统存在许多局限性，研究循环从患者和内皮细胞衍生的肿瘤细胞（CTCs的）之间的粘合相互作用主要是因为CTCs的是一种罕见的细胞群，从原发肿瘤脱落，其中数百万的血细胞循环（1 CTC每10 ⁹血细胞^）4。因此，无限量供应的培养细胞系的不同，低CTC计数导致很少和罕见的四氯化碳/ EC相互作用，需要适当的流道宽度来记录回放分析的相互作用。此外，由于来自患者的车辆检验中心是不纯的人口，因此识别标记是需要在特定的跟踪检验中心。为了解决这个问题，我们开发了一种新的方法，以确定前列腺癌（PCa）的CTCS通过利用几乎所有这些的CTC的表达前列腺特异性膜抗原（PSMA）在其细胞表面^5,6的事实的优点。在这份报告中，我们使用了前列腺癌细胞株，MDA PCa2b（MDA）含量，以展示我们的新系统来研究前列腺四氯化碳相互作用与内皮细胞的潜在效用，最终以了解有无转移的机制。

我们的方法可以应用于各种基于剪切实验模拟体内血管系统^7-9。除了检查前列腺四氯化碳/ EC相互作用，电流流室系统可以很容易地适应用于分析的外周血单核细胞或肿瘤细胞“与内皮的相互作用。拆卸和流动室的重新组装的简易性，一个^{microslideⅢ（0.1）（}以下简称microslide），使培养内皮下灌注和刺激内皮细胞有不同的细胞因子以诱导PRotein表达。此外，培养的内皮细胞，重组蛋白，如E-和P-选择素，可涂覆在microslide和相互作用与肿瘤细胞可以层流条件¹⁰下被观察到。

研究方案

1，培养内皮细胞上Microslides观察四氯化碳内皮的相互作用

1. 根据组织文化引擎盖，第一冲洗microslide，1毫米，用PBS通道宽度。轻轻外套用200μl的50微克/毫升用1毫升鲁尔锁注射器纤连蛋白（溶于PBS中）的microslide。
2. 盖上盖子的microslide，并保持它的组织培养罩内30分钟。在microslide液体的慢分配可防止气泡形成的通道。
3. 灌注200μl的温水（37℃）的HUVEC的生长培养基（M199媒体，1M HEPES，20％FBS，5毫克/毫升肝素，100μg/ ml的内皮细胞生长因子，和L-谷氨酰胺）在microslide孵育20分钟，在室温。在灌注，准备HUVEC细胞悬液。
4. 冲洗脐静脉内皮细胞用PBS加0.05％胰蛋白酶-EDTA在室温1-2分钟。离心机在内皮细胞在180×g离心5分钟2毫升生长培养基。
5. 使用neuba测量细胞浓度UER血球并准备10 ⁷个细胞HUVEC微升生长培养基。然后，小心地从用200微升枪头microslide的入口取出介质。
6. 使microslide到眼睛的高度，并用1毫升的鲁尔锁注射器，轻轻灌注200μl的脐静脉内皮细胞的制备的浓度的进入通道。注意，需要在这一步，以防止泡沫的形成。如果出现气泡，保持灌流一个稍长的时间，直到气泡进入出口通道。
7. 放HUVEC媒体等体积的（约80微升）在这两个入口和microslide的插座。这可以防止细胞在两个方向上的流动。
8. 覆盖滑动，并保持它在培养箱（37℃）为1.5小时。

2，准备流室组件的隔夜培养的HUVEC在Microslide

1. 放置一个无菌的20毫升注射器，女性和男性的鲁尔连接器，管道和注射器泵在培养箱中培养15分钟Ñ​​。
2. 对于最小的死体积，使用与0.04英寸内径的管道。较小的管径可以防止泡沫的形成。
3. 用温水（37℃）介质内皮细胞（12毫升）填充20毫升注射器。安装与连接器的油管到注射器。除去气泡。这个组件连接到microslide。
4. 完全充满HUVEC媒体microslide的入口。使填充20毫升的注射器连接到连接器旁边的microslide。轻轻将连接器连接到microslide。
5. 使集上放入培养箱，并将其连接到注射器泵中，设置在10微升/分的剪切速率。离开细胞O / N在孵化器在37°C
6. 第二天，通过去除附着在microslide的入口连接器拆卸的设置。
7. 上调内皮细胞上的E-选择素的表达，制备含IL-1β在10在4毫升媒体纳克/毫升的新鲜生长培养基。吸媒体在10毫升注射器。除去叔他从microslide的入口媒体和注射器连接到幻灯片中。
8. 设定注射器泵以10微升/分的剪切速率为在孵化4小时。

3，抗PSMA的制备（J591-488）标记的前列腺癌细胞

1. 在内皮细胞中IL-1β孵育，制备抗PSMA J591-ALEXA488标记前列腺癌细胞。添加0.05％胰蛋白酶-EDTA对MDA细胞1分钟。请勿将细胞胰蛋白酶更长的时间，因为它可以影响存在于细胞表面的糖肽。酶无细胞解离试剂，也可用于代替胰蛋白酶。离心机在200×g离心5分钟。
2. MDA重悬细胞沉淀于1毫升的H / H缓冲液（Hanks平衡盐solution/0.1％HSA/10毫米肝素钠/ 1毫米氯化钙_2）。添加抗PSMA J591-ALEXA488抗体在黑暗的地方20微克/毫升在室温30分钟。在温育过程中重悬细胞。
3. 30分钟后，离心分离，在800×g离心5分钟，将细胞溶液。 ASPI率和悬浮颗粒在1ml H / H缓冲液中。计数标记的MDA的细胞和使终浓度为1×10 ⁶细胞/ ml。填补5毫升注射器J591-488标记的MDA细胞及消除气泡。

4，抗PSMA（J591-488）标记的CTC富集的前列腺癌患者的制备

1. 收集7.5毫升血液前列腺癌患者在一个蓝色的帽筒（含柠檬酸钠）。轻轻地稀释血液1:1 0.1％BSA / 1毫摩尔EDTA / PBS中。
2. 加5.3毫升的Ficoll-Paque上加在50ml的锥形管中。层稀释血液的菲可帕克的顶部。离心机在400×g离心30分钟。
3. 预涂所有的管子或提示来在接触的CTC用2％FBS/RPMI-1640 / 1毫米氯化钙_2/4毫摩尔MgCl _2（R / S缓冲液），以防止的CTC的非特异性结合到表面上。维护媒体和缓冲区来与接触的CTC 4°C的温度。
4. 收集的外周血单核细胞（PBMCs）中馏分含的CTC从另一个50毫升锥形管中装有30ml的R / S缓冲器的接口。离心机在400×g离心8分钟。
5. 重悬沉淀，并在400×g离心8分钟的R / S缓冲洗一遍。离心后，沉淀重悬在H / H缓冲液中。添加抗PSMA J591-488抗体在黑暗的地方20微克/毫升在室温30分钟。
6. 30分钟后，离心分离含J591-488标记的CTC，在800×g离心5分钟的PBMC。重悬在H / H缓冲。填补1-ml注射器（预涂覆的R / S缓冲液中）与样本。

5，准备显微镜，注射泵和流动室组件

1. 打开倒置显微镜和设置柯勒照明在10X物镜。使注射器泵以相同的水平显微镜的试样台上，并将其设置为1达因/厘米²的剪切应力（〜10微升/分钟）。
2. 打开蔡司的AxioVision软件。选择计算机屏幕上的目标。创建一个新的在该软件中的工具选项文件夹。
3. 在的AxioVision打开智能实验选项，并调整设置为30分钟记录短短30秒的视频。
4. 对于实时荧光的视频，设置图像选项 - 12毫秒曝光，2×2箱，5增益。这些参数，可以在实现视频接近视频帧速率（〜每秒23帧）与蔡司MRM相机。
5. 可视化的流道的整个宽度在计算机屏幕上10 X目标，使用C型安装转接器（0.63 xf/60 mm接口）。
6. 开关上的水银灯。
7. 将注射器和含有细胞的连接器上的注射器泵。
8. 带来的IL-1β刺激的HUVECs从孵化器。请将此接头连接到含有内皮细胞的microslide的填充进口通道。
9. 连接的出口通道与连接到管道的连接器。把管子插入一盘菜或15毫升锥形管通过收集流量。
10. 启动infusi上通过microslide以10μl/分钟。观察内皮细胞和MDA标记细胞或下488纳米过滤器是来自于患者的落射荧光显微镜标记的CTC之间的相互作用。
11. 开始记录实验的30秒短片。在播放过程中分析，测量滚动速度。轧制速度除以细胞随时间移动的距离测量。

该Microslide 6。免疫染色

1. 对IL-1β刺激血管内皮细胞MDA灌注细胞10分钟后，从microslide的入口和出口中取出介质。
2. 用200微升尖，放温水（37℃）PBS中含有钙和镁成microslide 5分钟的入口。利用其作为盖在板凳上的一个道具倾斜microslide。保持microslide在一个倾斜的位置为免疫染色在所有的温育。
3. 修复血管内皮细胞由暖灌注2％的甲醛进入入口
4. 孵育20分钟，在RT。用PBS漂洗两次，每次5分钟。
5. 添加曲拉通X-100（0.1％）在PBS中5％BSA于室温10分钟。
6. 用PBS漂洗两次，每次5分钟。用在PBS中的5％BSA阻断30分钟。
7. 孵育一抗山羊抗VE-钙粘蛋白（1:100）在2.5％BSA的O / N在4℃下
8. 第二天，用PBS洗两次，每次5分钟。添加辅助驴抗山羊647抗体45分钟。用PBS，每次5分钟洗涤两次。
9. 在室温下孵育以人源化J591-ALEXA488缀合的抗体1小时。
10. 用PBS，每次5分钟洗涤两次。加DAPI 5分钟。用蒸馏水5分钟洗净。
11. 添加PBS（或MOWIOL对于长期贮存）。可视化的共聚焦显微镜下microslide。

结果

图1显示了内皮细胞上的microslide单层的O / N培养。 图1A上的定标显示，microslide 100％是可见用5X物镜，而70％是可见的用10倍的目标（ 图1B）。对于E-选择素介导的相互作用，细胞滚动的边缘不认为这使得microslide的70％以上，可用于视频录制和回放分析。根据我们的经验，最初这个设置程序集需要一些练习来培养内皮细胞的剪切应力作用下单层。在microslide建立EC?...

讨论

由于CTCs的血细胞中的数量低，这是难以分离的CTC作为信元的纯群体。为了研究四氯化碳/ EC相互作用，车辆检验中心的稀有和不纯的人口带来了两大挑战：1）血细胞中车辆检验中心鉴定的;二）四氯化碳/ EC相互作用观察。

为了克服识别血细胞中前列腺车辆检验中心的一个限制，我们注意到，几乎所有的前列腺肿瘤细胞表达PSMA ⁶的事实。单克隆抗体...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microslide	Ibidi	80331
Fibronectin	Millipore	FC010
Plastic tubing	Cole Parmer	EW-96115-08
Male Luer adapter	GlycoTech	31-001
Female Luer adapter	GlycoTech	31-001
Syringe pump	Chemyx Inc	Fusion 100
Luer-lock syringe	BD Biosciences	309628
M199 medium	Sigma	M7653
Endothelial Mitogen	Biomedical Technologies	BT-203
HBSS	Sigma	H9269
Anti-PSMA J591-488	Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology
Interleukin-1 beta	Peprotech	200-01B
Trypsin	Millipore	SM-2002-C
Heparin	Sigma	H-3149
HUVECs	Weill Cornell Medical College-Department of Surgery		provided by Marco Seandel
VE-Cadherin	Santa Cruz	sc-5648
10x objective	Zeiss Plan Neofluar
Enzyme free cell dissociation reagent	Millipore	S-004-C
RPMI-1640	Lonza	12-702-F
Ficoll-paque plus	GE healthcare	17-1440-02