牛痘病毒记者量化病毒功能在基因表达的各个阶段

摘要

我们描述了一种荧光报告牛痘病毒，使病毒的感染性和基因表达的实时测量通过的光谱不同的荧光报告基团的阶段特异性表达的用法。我们详细的板基础的方法准确地确定在哪个病毒复制受到影响响应小分子抑制阶段。

摘要

痘病毒是一个家族的双链DNA病毒，包括有源人类病原体如猴痘，软疣contagiousum和Contagalo病毒。该系列还包括天花病毒，天花。由于痘病毒复制的复杂性，许多问题仍然对他们的基因表达的策略。在这篇文章中，我们描述的重组痘苗病毒，使之在高通量形式病毒基因表达的单一和多级实时测量的概念和用法。这是通过使用光谱不同的荧光蛋白作为报告的每个病毒复制的三个阶段启用。这些病毒提供了高的信号噪声比，同时保持阶段特异性表达模式，使板为基础的检测和病毒繁殖和复制的显微观察。这些工具具有用途抗病毒药发现，病毒 - 宿主相互作用的研究，和进化的生物迟缓。

引言

传统上，病毒表达是利用分子生物学技术（ 例如，RNA印迹法，蛋白质印迹法，微阵列杂交， 等等 ^）1研究。虽然这些方法能够提供详细的信息相对于个别分类的mRNA或蛋白质的表达的变化，它们通常不适合于实时性和高通量处理。采用基于荧光的记者替代方法与痘病毒工作时，先前已被应用;然而，他们的开发和使用已经出于不同的目的。一些这样的方法被设计为选择的重组病毒^2,3。这些技术表达绿色荧光蛋白在适当的成立和从重组痘苗病毒克隆外源DNA的表达。类似地，一些牛痘株稳定表达可溶性EGFP或下一个本机牛痘启动子表达GFP标记的蛋白已被广泛使用。这些都是典型售货机，ically用于定量病毒进入及复制过程中的基于抗体的中和测定法，化学抑制，或抗病毒效力^4-6比较。尽管这些病毒已经被证明非常有用，他们在向因单一暧昧早/晚病毒启动子及其用法提供了有关抑制的点的详细信息的能力是有限的。以前的方法也取得了利用EGFP蛋白的次优的信号 - 噪声特性。

由于痘病毒复制和缺乏可用以测定在病毒基因表达的实时变动对现有工具的复杂性，我们开发了一套单级和多级记者病毒^7,8。如在以前的出版物中描述的，这些病毒表达一种，两种，或从天然痘苗病毒启动子3在光谱上不同的荧光蛋白在早期，在感染中间，或最后阶段。这些病毒可能是我们编为病毒复制进度使用荧光显微镜的指标和它们同样适合于高通量的基于平板和阅读器测定。这些病毒很容易在地方的野生型病毒的使用，具有类似的动力学成长，达到相当于滴度^7。在策划和创作的这些病毒，很在意拍摄于选择具有高信背景特征具有超强的折叠效率的荧光基团，以方便可靠的定量分析与快速反馈的变化，表达（金星的mCherry和TagBFP）。此外，病毒启动子的组合被选择能产生高保真的，明确的阶段特异性表达，提供有关的全方位早期（C11R启动子）的信息，中间体（G8R启动子）和晚期（F17R启动子）的基因表达，而相比之下，暧昧早/晚推动者。

这些病毒可以作为用于英伟的工具stigating原型痘病毒，牛痘病毒的生命周期。现在还是有很多不知道的宿主 - 病毒相互作用，尽管其悠久的研究历史。牛痘是复杂的，生产超过200独特的蛋白质，其中有许多是免疫调节和主机对立。一旦感染病毒，牛痘病毒立即开始早期mRNA的转录。这是通过被在病毒粒子的包装上的病毒基因组中加载并在暂停状态保持到随后的感染RNA聚合酶和转录因子的促进。这种早期的表现主要生产所需的抑制宿主的免疫系统（mRNA的脱帽，dsRNA的封存和诱饵受体蛋白以及细胞凋亡的抑制剂，应激反应和收费，白细胞介素，和NF-κB信号）和基因组复制的蛋白质。早期表达也产生必要的中间表达的转录因子。中间表达式包括后期转录因子的表达。这表达级联导致生产结构和酶的病毒蛋白质在感染的晚期阶段，这是必要的成熟牛痘病毒体的完整组件。

我们组的荧光记者病毒可以快速进展痘病毒生物学的理解作出。一个在病毒学领域中最常见的和费时的方法是在生长测定。这通常涉及到感染细胞，通过裂解感染的细胞颁布一系列的处理，收获病毒，并通过噬菌斑测定法量化所得到的病毒滴度。使用此处描述的记者病毒允许病毒生长的实时测量，可以很容易检测和并行执行大量的处理之间进行比较。我们预计这组试剂将用于各种协议确定响应药物治疗，RNA干扰K的病毒基因表达的改变nockdown，或宿主范围的限制。

此方法也允许的规模比以前提供更大的高内涵分析，允许高通量的抗病毒的药物屏幕对于感兴趣专门定义的目标的阶段。虽然打击痘病毒感染许多潜在的治疗方法已经确定，唯一被FDA批准的治疗有效治疗痘病毒感染是无环核苷膦酸酯，西多福韦和牛痘免疫球蛋白^9,10治疗。尽管消灭天花，1977年^11，痘病毒仍然是一个显著威胁人类健康^12。对天花病毒的广泛接种疫苗的终止，导致易感性增加其他痘病毒^13。例如，中非以前接种疫苗保护的地区在猴痘病毒感染¹⁴激增。显著的关注也一直提出了关于潜在的易感性天花病毒的有意释放。由于目前可用的有限的疗法，目前迫切需要对新疗法的发展。这些记者病毒允许快速和高通量小分子抑制剂筛选抑制病毒复制的特定阶段。针对病毒表达阶段抑制目前不是目标抑制剂的鉴定将有利于联合疗法的发展与提高的效力。

要通过观察变化，每个阶段的基因表达进行搜集了关于牛痘细胞生物学。衰减通过化学或感染的宿主细胞的遗传操作通常以降低病毒滴度表示。然而，通过比较改变的病毒表达级联的每一级，可以得到怎样的病毒适应度的影响更完整的理解由一个特定的治疗主编。这些数据已经显示出与传统的病毒滴度输出良好的相关性，但提供更详细的机理信息，以及高吞吐量能力^7。

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研究方案

1，电池板

1. 从板分离HeLa细胞在生长培养基（DMEM，2mM的L-过剩，10％FBS）中稀释至约2.0×10 ⁵个细胞/ ml。分配100μl/孔在黑色壁，透明平底96孔板（20000个细胞/孔）。
2. 孵育细胞24小时，直至汇合在37℃培养箱+，5％CO _2。

2，感染细胞

1. 稀释病毒和感染细胞。
   1. 解冻TRPV（三人间病毒;早期金星，中级的mCherry，晚TagBFP）和PLV（启动子的维纳斯）荧光病毒和分解利用超声处理5分钟。或者，粗病毒储备可以1:1的比例混合，用0.25毫克/毫升胰蛋白酶在感染媒介并在37℃下进行30分钟。
   2. 稀释原油库存病毒在37℃感染培养基（DMEM，2毫米L-供过于求，2％FBS）。对于高MOI感染（10 PFU /细胞），病毒稀释股票1.0×10 ⁷ PFU / ml的假设5×10 ⁴细胞/孔和50μl的接种物体积。在感染3重复孔的每个治疗TRPV和另外3重复孔与PLV考虑到具体到每个处理背景荧光相同的治疗方案。
   3. 通过加入50μl/孔稀释病毒感染媒介传染井。这被定义为时间= 0小时感染后（0 HPI）。
2. 淡化理想的治疗化合物转化为感染媒介。对于所有的治疗单倍母液稀释应作出并应用到复制井（六96孔如 350μl总体积各50微升）。
   1. 稀释试验化合物为感染媒介。
   2. 稀车辆控制溶剂（ 如 PBS，DMSO）为感染媒介。注意：类似的最终浓度车辆用控制溶剂的应该被用作施加试验化合物（ 例如：如果你的IBT股票被用DMSO中，并在最终的concentratio使用1微升的NS /毫升，然后用DMSO独自在1微升/毫升作为车辆控制）。
   3. 稀释对照化合物为感染媒介。推荐控制的化合物包括：3.6μM（1微克/毫升）1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶（阿糖胞苷），50μM（11.7微克/毫升）的靛红β-缩氨硫脲（IBT），60微米（50微克/毫升）利福平或5微米（1.9微克/毫升）ST-246 ^8,15,16。看到预期的效果代表性的成果。注意：使该稀释的两倍（2×）的所需终浓度，因为这是在以1:1的比例添加到该卷已在井中。
3. 立即加入病毒后，加入含有所需的治疗和控制的稀释步骤2.2 50微升传染媒介。注意：为了早期表达前测定为抑制，化合物（S）可以被直接加入到稀释的病毒接种物（步骤2.1.2）或感染之前对宿主细胞（步骤2.1.3之前）。
4. 孵育6-24小时在37＆＃176，C培养箱+，5％CO _2。

3，修复细胞

1. 通过加入100微升8％多聚甲醛到感染介质已经在每个孔中固定的细胞。在室温下孵育为避光15分钟。注：建议到2倍的PFA（8％）直接添加到传染媒介，以防止可能发生的感染牛痘的气雾，如果高滴度的媒体直接倒到垃圾盘前固定。
2. 通过翻转板进入废菜除去固定液。
3. 加入100μl室温的PBS。
4. 与光学透明粘结膜封板。注：板可存放在4℃下，如果不立即读取。请务必阅读，以防止冷凝扭曲分光光度计测量前返回封板至室温。

4，量化病毒生长

1. 测量终点的​​荧光在515:53​​0金星，587:610的的mCherry，和415:457 f或TagBFP（励磁：在nm发射波长）。四个测量应每口井使用的每个通道优化增益设置进行平均。注意：适当的发射波长可能不同，具体取决于您的平板阅读器的具体型号和滤波特性。这可以通过经验进行发射波长扫描，以确定该点那里是为每个通道TRPV与PLV之间的最大差额进行确定。
2. 归一化的原始数据，以方便实验之间的比较。
   1. 对于每个信道，确定复制TRPV和PLV孔的平均值。
   2. 减去平均TRPV感染的实验测量每个治疗的平均PLV感染的背景测量。
   3. 通过将每个背景值中减去由车辆只值以及规范化的数据。
   4. 一次实验被重复多次，方差单向分析（单向ANOVA）检验和多Çomparison检测后可以进行，以确定是否任何的处理反映从每个通道的车辆唯一的治疗在统计学显著差异。

5，替代协议：动力板测定

1. 通过另外的方法执行的所有步骤（步骤2.3）。
2. 封板，在酶标仪室粘结膜和地方平衡至37°C。注：必须特别注意​​采取保持一致板在37°C，以防止过度的细胞应激和冷凝。对于动力学分析，这是特别重要的是使用一个缓冲介质（碳酸氢钠和HEPES），以保持适当的pH值不添加5％的CO _2。
3. 手动设置酶标仪获得，以防止稍后的时间点饱和。注：准确的增益优化可以通过执行类似条件下的端点检测得到。
4. 收购每小时读数8-24 HPI和使用规范化西米征地拆迁过程中的端点检测（步骤4.2）。
5. 个别时间点可以使用类似的方法如先前所描述的端点测定统计显着性进行分析。

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结果

因为这些病毒的典型用法的示例，三重荧光记者病毒被用来抑制的几个定义良好的痘病毒抑制剂的点进行比较。

将HeLa细胞接种在组织培养物处理的黑色壁透明平底96孔板中并孵育过夜。汇合的单层细胞感染在感染使用任一三重记者病毒的多重10（MOI）（TRPV， 表1）或启动子的金星（PLV）所详述的板图（ 图1）上。加入含有治疗感染媒体取得0.1％DMSO，3....

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讨论

这里，我们描述了一种多级牛痘记者病毒（TRPV），它提供病毒复制的重现性，实时反馈测量的实际使用情况。通过使用良好定义的痘病毒的抑制剂，我们能够显示，TRPV与动作的每个抑制剂的理解机制相一致的方式进行响应。而TRPV病毒提供了有关病毒阶段级数最全面的信息，两阶段（IREV，LREV）和单级（EV，IV LV）的病毒，也可以类似地使用，同时考虑最优的蛋白质折叠的优点，稳定和优异的信号?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3603
384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates	Corning	3712
Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO)	American Bioanalytical	AB03091
1-β-D-Arabinofuranosylcytosine  (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
Rifampicin, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	157-8
TempPlate RT optically clear film	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985-070