RNA催化剂作为记者为筛选药物对RNA编辑在锥虫

摘要

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

摘要

实质性的进展已经取得了确定的线粒体RNA编辑在锥虫的机制。同样，相当大的进展已经取得了识别editosome络合物的催化RNA编辑的组件。但是，目前还不清楚这些蛋白质是如何协同工作。从对editosome高通量筛选获得的化学化合物可以阻止或影响在编辑周期的一个或多个步骤。因此，新化合物的鉴定将产生有价值的分子探针解剖editosome功能和组装。在以前的研究中， 在体外测定法的编辑进行了使用放射性标记的RNA。这些测定法是耗时，低效和不适合于高通量的目的。在这里，均匀的荧光为基础的"混合和计量"锤头状核酶体外记者分析监测RNA编辑，呈现。仅作为RNA编辑的结果锤头状核酶荧光共振能量转移（FRET）寡基板发生裂解。这反过来导致荧光团与猝灭剂，从而产生一个信号分离。与此相反，当editosome功能受到抑制，荧光信号会被淬灭。这是一个高度敏感和简单的分析，应该是普遍适用于体外 RNA编辑或化学物质，可以抑制editosome功能的高通量筛选监控。

引言

RNA编辑，转录后修饰的mRNA的过程中，首先被锥虫¹发现。从那时起，大量的工作已经在后面学习中的RNA编辑布氏锥虫 ^2,3机制进行的。在一系列的酶反应中，editosome，约20蛋白核心复合物，产生成熟的mRNA线粒体的能量产生的氧化磷酸化系统的多个组件。催化事件的顺序是信使核糖核酸，尿苷酸（U）增加或删除，并结扎，所决定的指导的^{RNA（gRNAs）4。}

除了 ​​核心editosome复杂的蛋白质，一些辅助因子也已确定^5-7。这些蛋白质大多见于分组独立的复合物。然而，蛋白质装配在芯editosome复杂的顺序和核心复合物与该配件的交互模式配合物尚未确定。针对RNA编辑的过程中锥虫可提供化学解剖，援助在研究editosome复杂的装配和功能。此外，在几个editosome蛋白质功能的研究表明在不同人生阶段的必要性，指出其潜在的药物靶点^8-12。因此，editosome的发现抑制剂也可作为对锥虫的先导化合物。这是及时的，因为目前市面上所引致的锥虫病的药物是有毒的，低效和昂贵^13,14。

一个高效，便捷的体外试验要探索的化学宇宙，阻止RNA编辑特异性抑制剂。三个实验已经开发并用于监视editosome活动:（a）全轮体外 RNA编辑分析^15（二）预切割体外 RNA编辑实验^16,17，一ND（三）锤头状核酶（HHR）为基础的检测^18。前两个实验依靠编辑的产品（ATP酶6基因）与放射性的帮助下直接观察。该HHR基测定法使用了被建模的行为作为经编辑的核酶的ATP酶6 mRNA的修改版本。功能核酶则特异性切割放射性标记的RNA底物，作为一名记者。最近，MOSHIRI 等人开发了一种"混合，并测量"HHR-基于体外报告基因分析来监测RNA编辑其中的放射性标记的RNA底物被替换为荧光共振能量转移（FRET）底物^19。该测定法的原理的优点是:（a）它是一种快速和方便的混合和测定法的测量类型，为生产活性核酶和底物裂解的同时出现在同一试管中低体积（ 即 20微升），（二）它避免了使用放射性标记的物质，（C）的灵敏度是一个通过荧光仪在微滴定板格式，以及（d）一个高信噪比fforded。使用这种测定法，对纯化的editosome已知的RNA编辑连接酶抑制剂的作用被证实^19。这个实验验证了分析的快速鉴定RNA编辑酶抑制剂，主要针对来自T.整个editosomes 布氏 。

图1是一个详细的一步一步的示意性的基于荧光的体外 RNA编辑测定。这个协议可以被用于监测在体外 RNA编辑或很容易地适应用于筛选各种比例的化合物库。

研究方案

下面的协议描述了用于执行基于荧光的RNA编辑分析的过程。该测定法可以在一个单一的PCR管，96孔或384孔取决于实验的范围板来进行。随后的荧光信号可以读合适的实时PCR检测系统。这里在测定中的384 - 孔板的上下文中被描述。

1，培养T。布氏细胞

1. 准备一个生长培养基为T。布氏 procyclic形式的细胞。 1 L培养基:
   1. 溶解25.4克SDM-79粉末在800毫升miliQ水。
   2. 添加2克的NaHCO ₃和pH值至7.3，10 M氢氧化钠。
   3. 加超纯水至900毫升，过滤消毒的最终体积。
   4. 添加胎牛血清（FBS），青霉素 - 链霉素溶液和氯高铁血红素（2.5毫克/毫升）至终浓度为10％（体积/体积），分别为100单位/毫升和7.5毫克/升。
2. 成长300毫升T. <中EM>布氏1.7A野生型（procyclic形式）细胞在28℃，在70转摇到1.5×10 ⁷细胞/ ml的密度。注:这应该会产生3毫升活跃editosome与〜0.5毫克总蛋白，足够600编辑反应。
3. 离心6000×g离心10分钟收集细胞，在4℃下
4. 用50ml冷PBSG缓冲液（10mM的_磷酸氢二钠，10mM的的NaH ₂ PO _4，145 mM氯化钠，以及6毫米的葡萄糖）洗涤沉淀，并再次离心收集到的细胞通过离心分离以10,000 xg在10分钟4°C。

原油线粒体2。隔离

注意:所有的步骤应在冰上或4℃进行保存editosome活性。

1. 重悬在30毫升的DTE缓冲液（1mM的Tris-HCl pH为8.0和1mM EDTA）中收获的细胞。用40毫升无菌Dounce匀浆（预冷）由抚摸着向上和向下的至少10倍于冰上，破坏细胞膜。
2. 立即4.3毫升60％蔗糖（w / v的即 1.75 M）添加到匀浆至0.25米离心机的终浓度在15800×g下在4℃下10分钟，以优先减低线粒体。
3. 重悬线粒体沉淀4.6毫升STM缓冲液（20mM的Tris-HCl pH值8.0，250mM的蔗糖和2mM的MgCl _2）。添加13.8微升的0.1M的CaCl ₂和4微升不含RNA酶的DNA酶I至终浓度分别为0.3毫米和9 U /毫升。为1小时，在冰上孵育混合物。
4. 添加4.6的STE缓冲液（20mM的Tris-盐酸pH值8.0，250mM的蔗糖和2mM EDTA）中在4℃以灭活DNA酶I。离心机在15800×g离心10分钟
5. 重悬沉淀中加入400μl的裂解缓冲液（10mM的Tris-HCl（pH7.2）中的10mM的MgCl _2，100mM的氯化钾，1微克/毫升胃蛋白酶抑制素，1mM的DTT和1×完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂），并转移到离心管。
6. 加10％的Triton X-100至1％的终浓度第二温育裂解物15分钟，在4℃下在管式旋转器。
7. 离心两次在17000×g离心15分钟，在4℃下清除线粒体裂解液;每次保留清除上清液。

3。Editosome净化

1. 倒入10ml的10％-30％（V / V）线性梯度甘油（ 表1）中使用2个HHE梯度缓冲液（40mM的HEPES pH值为7.9，20mM的镁（醋酸_）2，100mM的氯化钾超速离心管中，并2 mM EDTA）中，并通过下面的说明书的梯度壶。
2. 小心地从甘油梯度的顶部取出500微升的溶液，轻轻地加载500微升的清除线粒体裂解液。旋在178,000 xg离心6小时，在4℃下用超离心。
3. 收集500μl的级分连续地从顶部到梯度的在4℃下然后将其卡冻结使用液氮和储存在-80℃直至使用的馏分。

4。 RNA制备

1. 退火含有互补序列的T7启动子序列（ 表2）与T7启动子的寡核苷酸（5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'）中，加热至90℃保持3分钟以1:1的摩尔比和冷却在RT相应DNA模板为至少10分钟。
2. 使用体外转录试剂盒由以下的说明书转录的RNA。
3. 停止转录反应通过加入7M尿素染料（7M尿素，0.05％二甲苯Cynol，和0.05％溴酚蓝）等体积。在消毒9％变性聚​​丙烯酰胺凝胶（9％丙烯酰胺，7M尿素，1×TBE）过滤器运行。
4. 使用紫外线（UV）遮蔽用短波紫外线灯进行定位和切除相应的RNA。将切下的凝胶块在一个离心管中，并加入400微升的凝胶洗脱缓冲液（20mM的Tris-HCl pH值7.5，250mM的醋酸钠，1mM EDTA和0.25％SDS）中。洗脱过夜在RT上一个管肩。
5. PRECI通过加入1ml冰冷的100％乙醇并进行培养或在-80℃下30分钟或-20℃过夜pitate洗脱RNA。
6. 离心机以16,000×g离心30分钟，在4℃，以沉淀下来的核糖核酸。
7. 用1毫升75％乙醇洗涤沉淀。离心机以16,000×g离心20分钟，在4℃下
8. 适当地重悬RNA沉淀在无RNA酶的水以达到所需的浓度，如表2所示。

5，基于荧光的RNA编辑含量

1. 为一个单一的反应，结合1皮摩尔（1微升）preA6Rbz和2.5皮摩尔（1微升）gA6Rbz的（1:2.5摩尔比）在微量离心管中，孵育在70℃维持3分钟，并让其在室温下静置在至少10分钟。
2. 同时使用表3中制备主混合物，而不preA6Rbz和gA6Rbz，对于含有1x HHE缓冲液（25mM HEPES pH值为7.9，10mM的镁（醋酸_）2，50mM的氯化钾和10mM EDTA），1 mM的编辑反应ATP，5mM的氯化钙_2，圆酵母RNA，0.1％的Triton X-100和纯化的editosome 16纳克/微升。
3. 添加退火preA6Rbz和gA6Rbz完成主结构。
4. 免除18微升主混合物（ 表3）的成包含2微升不含RNA酶的水（井用无化合物）或2微升200μM的化学化合物的井，并按照图5包括对照样品中的板。
5. 密封板与板密封件和旋转盘下来，以消除任何气泡。孵化在28℃保温4小时。
6. 添加25皮摩尔gA6Rbz竞争者（2微升）到每个孔中。放置一个新密封剂，向下旋转的板，并把它实时PCR仪上。程序如下实验:
   第1步:85℃5分钟;第2步:24℃，10分钟;步骤3:停止。
7. 加FRET底物的15皮摩尔（1微升）到每个孔中，以23微升的最终体积。用新鲜的封口机封板。快速旋转盘，并把它背在实时PCR仪上。
8. 设定新的实验步骤如下:
   第1步:37℃1分钟;第2步:阅读;第3步:进入步骤1，40倍;步骤4:停止。
9. 安装板通过选择所有需要阅读和选择FAM过滤器的井。输入量为23微升并开始运行。
10. 计算从每个孔/样品获得通过绘制的斜坡上的条形图进行分析，以获得动力学测量值的斜率。注:动能读提高了样品和背景之间的信号噪声比;作为背景样品将有一个斜率接近于零。结束点读具有较高的背景噪音。

结果

以证明需要设立一个大型屏幕必要的步骤， 图2-5是与测定的质量代表对照实验。这些都是必不可少的对照实验为一致的测定过筛选的几天或不同的屏幕之间的对比。

评估荧光信号噪声比

以确保在一个大型安装的荧光素标记的寡核糖核苷酸底物的稳定性和质量，Z'因子，其定义为在测定背景和最大信号之间的差用的是活性核酶...

讨论

一种新型的高通量筛选方法来确定对锥虫的RNA编辑复杂的抑制剂已提交，为药物发现的新工具来对抗引起的锥虫病。基于FRET的核酶法已被广泛地用于不同的用途^20-22;然而，我们动用的体外监测RNA编辑活动¹⁹ FRET为基础的核酶分析的能力。该测定可能适用于其他类型的RNA编辑在真核生物，如哺乳动物²³的核编码的RNA的核苷酸替换编辑。

该测定中的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SDM-79 Medium	Gibco by Life Technologies
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12483-020	heat inactivation at 55 °C for 1 hr
Hemin, minimum 80%	Sigma	H5533-10G
Penicillin-Streptomycin Sollution	Fisher Scientific	MT-30-002-CI
Dnase 1 recombinant, Rnase Free	Roche	4716728001
T7 RiboMax Express Large  scale RNA  production system	Promega	P1320
Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders	Fisher Scientific	K885300-0040
Gradient Master, ver 5.25	Biocomp	107-201M
Ultra Clear Tube, 13.2 ml	Beckman Coulter	344059
Optima L-100XP  Ultracentrifuge	Beckman Coulter	392052
SW 41 Ti ROTOR	Beckman Coulter	331336
MicroSeal 'B' Seal, Seals	Biorad	MSB1001
CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	185-5484
Acryl/Bis solution (19:1), 40% (w/v)	Bio Basic	A0006-500ML
Urea, Molecular biology grade, 1 kg	Life Technologies	AM9902