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  • 摘要
  • 摘要
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  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

摘要

广泛使用的新一代测序开辟了为癌症研究和诊断的新途径。农工商会带来癌症大量的新数据，尤其是癌症遗传学。目前的知识和未来发现将使得有必要研究一种巨大的基因可能涉及遗传因素对癌症的数目。在这方面，我们开发了一个Nextera设计研究11参与DNA损伤修复完整的基因。该协议的开发是为了安全地同时学习11个基因（ATM，BARD1，BRCA1，BRCA2，BRIP1，CHEK2，PALB2，RAD50，RAD51C，RAD80和TP53）从启动到3'-UTR 24例。这个协议中，根据转座技术和基因组DNA富集，给出了一个很大的优点的时间为基因诊断由于采样复用条件。这个协议可以安全地使用与血液的gDNA。

引言

2010年，有近150万人（主要是女性）开发的全球乳腺癌。据估计，5％至10％的这些情况是遗传的。大约20年前，BRCA1和BRCA2被认定为参与遗传性乳腺癌和卵巢癌1。自从大约15年前，BRCA1和BRCA2基因的编码区已被测序，以确定遗传倾向的乳腺癌和卵巢癌。在BRCA1和BRCA2的变化在10％至20％选家庭2表明这些区域的分析是不够有效的筛查检测。近日，BRCA1和BRCA2基因的非编码序列（启动子，内含子，3'UTR）的分析，强调了新的基因突变/变异可能与乳腺癌3-6的风险较高。

BRCA1和BRCA2蛋白参与同源重组修复（HHR），它是由众多的合作伙伴7完成。而在BRCA1或BRCA2基因的改变诱发的DNA修复缺陷，其他伙伴也可能会影响到乳腺癌的危险性。这个假设似乎因为BRIP1 8已被验证，PALB2 9对宫颈癌和乳腺癌的一个行之有效的影响，分别为。此外，还有两个其他的"中度风险"的乳腺癌易感基因，ATM和CHEK2，也可以定期研究10。

从这些研究之后，我们决定开发一个协议分析11个基因（ 自动取款机，BARD1，BRCA1，BRCA2，BRIP1，CHEK2，PALB2，RAD50，RAD51C，RAP80和TP53），24例同时使用一个非常简单且相对基于转座技术快速的协议，以充实和测序中等吞吐量的设备上。谢谢该技术，我们测序完成基因的启动子的3'-UTR的端部的起动，除了RAP80，对于其中的2500 bp的内含子区域没有被覆盖的（CHR 5:176,381,588-176,390,180）。这代表共约1000300 BP研究与2,734探头。通常，BRCA1和BRCA2的外显子序列由Sanger测序，这需要1.5个月时间少于20名患者进行分析。本协议（ 图1），在相同的时间，11个完整的基因为大于75的病人可以进行分析。

研究方案

基因组DNA 1。评估（基因组DNA）产量

  1. 量化新鲜提取基因组DNA的制备图书馆前。使用荧光估产方法量化完整的基因组DNA（避免使用分光光度计进行基因组DNA的产量评估）。测量（二百八十零分之二百六十nm）的比率，并确保它是在1.8和2注:50纳克基因组DNA的需要进行实验。

2，基因组DNA富集:第1天，上午

  1. 开始之前
    1. 从DNA富集试剂盒（见表材料/设备），解冻DNA缓冲液（TD）和冰的DNA酶（TDE1）解决方案。至少30分钟，在使用前，使纯化的磁珠和停止目标（ST）的缓冲液至室温（RT）。每个样品中添加20微升基因组DNA样品在2-2.5纳克/微升直接放入96孔板中，1个井。重要提示:使用阳性对照，以验证协议（与已知序列变异样本）。
  2. Tagmentation
    1. M九，所有试剂彻底颠倒5倍，后短暂离心。在室温，加入25微升的TD缓冲液到每个孔中含有50的gDNA纳克（20微升），然后取5μl的TDE1缓冲器。将吸管50微升，轻轻吸取整个音量上下10倍。
    2. 覆盖板用粘接膜和离心机在280 XG 1分钟，在20℃。然后，将板在热循环仪（盖在100℃加热），然后运行下面的程序:55℃5分钟，10℃，无时间限制。
    3. 在此培养后，制备与实验管理器软件的样品片材，以定义将要使用的索引。
  3. Tagmentation净化
    注意:该步骤是关键的。要非常小心。
    1. 检查无沉淀净化磁珠和ST缓冲器。如果沉淀物存在，热身手中的解决方案。解冻再悬浮缓冲（RSB）冰上。
    2. 在RT下，涡街溶液和添加15μl到每个孔中含有的样品。将吸管65微升，轻轻吸取整个音量上下10倍。孵育5分钟，在室温。覆盖板和离心机在280 XG 1分钟，在20℃。
    3. 加入52微升的预先混合纯化的磁珠在每个孔中。将吸管117微升，轻轻吸取整个音量上下10倍。下室温温育10分钟。覆盖板和离心机在280 XG 1分钟，在20℃。
    4. 除去粘合膜。放置在96孔板上的磁性支架在室温2分钟。确保上清出现彻底清除。
    5. 制备新鲜的80％乙醇溶液（24个样品，加入2毫升蒸馏水至8毫升乙醇中）。取出并弃去上清液，注意不要打扰珠。
    6. 同时使板在磁性支架，加入200微升新鲜制备的80％乙醇中，以每孔，而不会干扰珠孵育该板为至少30秒在室温下进行。弃上清，重复此洗了第二次。确保乙醇已被删除。让干燥，在室温下搅拌10分钟或直到乙醇完全蒸发。
    7. 从磁底座上卸下板并添加22.5微升RSB缓冲。移液器设置为22.5微升，轻轻吸取整个体积上下10倍。放置在96孔板上的磁性支架并孵育2分钟。确保上清出现彻底清除。轻轻的转移在一个新的96孔板20μL上清液。
      注意:任选地，通过使用一个片段分析器确定tagmented样本的大小。而不是上面提到的步骤，使用高分辨率的丙烯酰胺凝胶电泳。片段应为150个基点至1000个基点之间。
  4. 第1次PCR扩增
    1. 解冻PCR扩增预混含有聚合酶（LP-PMM），索引1引，索引2引物溶液在冰上。匹配组合Ø˚F指标与实验管理器示例表。对于多路，准备从索引1（I7，N7xx）对每个样品不同I7。
    2. 在每孔加入20微升的LP-PMM，5微升指数1和5微升指数2将吸管50微升，轻轻吸取整个音量上下10倍。覆盖板用粘合剂微密封膜。离心机在280 XG 1分钟，在20℃。
    3. 将板在热循环仪（盖在100℃加热），然后运行程序1（ 表1）。
      注:该过程可以停止在这一点上与该反应过夜储存在热循环或2至8℃下2天。

3，基因组DNA富集:第1天，下午

  1. 开始之前
    1. 融寡聚物（CSO），捕获目标缓冲器1（NCT1），并在冰上RSB的解决方案。至少30分钟，在使用前，使纯化的磁珠至室温。
  2. PCR纯化
    1. 从步骤2.4离心盘，持续1分钟，在280 XG在20℃。
    2. 在RT下，在各孔中加入45微升混合纯化的磁珠。移液器设置为95微升，轻轻吸取整个体积上下10倍。下室温温育10分钟。放置在96孔板上的磁性支架在室温2分钟。
    3. 确保上清出现彻底清除。制备新鲜的80％乙醇溶液（24个样品，加入2毫升蒸馏水至8毫升乙醇中）。弃去上清液，注意不要打扰颗粒。
    4. 同时使板在磁性支架，加入200微升新鲜制备的80％乙醇中，以每孔，而不会干扰珠孵育该板进行30秒，在室温下进行。弃上清，重复此洗了第二次。确保乙醇已被删除。让干燥，在室温下搅拌15分钟。
    5. 从磁底座上卸下板加入40μl的RSB缓冲。设置管TTE至40微升，轻轻吸取整个音量上下10倍。
    6. 放置在96孔板上的磁性支架并孵育2分钟。上清应该出现彻底清除。轻轻转移38微升上清液到新的96孔板中。
    7. 测定各样品的通过荧光法的产率。如果所评估的产率是30至50纳克/微升之间的协议的第一部分将被验证。
  3. 1号杂交
    1. 普尔高达每池12个样本在这个阶段通过将500ng的每种样品中一种新的96孔板中。确保每个池的最终体积不超过40微升。
      注:如果需要的话，减少池的体积通过使用真空浓缩装置​​在RT（注意:DNA的浓度而不能加热进行修改，即使在30℃下加热使DNA降解）。通过添加RSB溶液调整最终体积至40微升。
    2. 充分混匀NCT1解决方案。对于每个孔含有40微升合并的DNA样品中，加50微升NCT1的，和10μl的CSO。移液器设置为100微升，轻轻吸取整个体积上下10倍。密封该板，并离心1分钟，在280 XG在20℃。
    3. 将板在热循环仪（盖在100℃加热），然后运行程序2（ 表1）。

4，基因组DNA富集:2日，上午

  1. 开始之前
    1. 从DNA富集试剂盒（见表材料/设备）解冻2 N氢氧化钠（HP3），目标洗脱缓冲液1（ET1），目标洗脱缓冲液1 ET2，链亲和素磁珠（SMB），洗涤液1（WS1），洗解决方案2（WS2），洗涤液3（WS3），CSO和NCT1解决方案，在室温。
  2. 1号杂交洗
    1. 从该热循环和离心分离1分钟，在280 XG取出96孔板在20℃。取下粘合盖很carefuLLY。
    2. 从平板转移100μl的反应混合物到新的MIDI 96孔板中并加入250微升以及涡旋SMB溶液。移液器设置为350微升，轻轻吸取整个体积上下10倍。密封该板，并在室温下孵育30分钟。
    3. 离心机在280 XG 1分钟，在20℃下，除去了粘合剂密封，并放置在盘上的磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。弃去上清液，并从磁性底座上卸下盘。
    4. 加入200μl的良好混合WS1溶液进入井含珠。移液器设置为200微升，轻轻吸取的整个体积上下15X避免气泡/泡沫形成。
    5. 将板在磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。弃去上清液，并从磁性底座上卸下盘。
    6. 加入200μl的良好混合WS2溶液进入井其所含进不去珠。移液器设置为200微升，轻轻吸取的整个体积上下15倍，避免形成气泡/泡沫。
    7. 将板在磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。弃去上清液，并从磁性底座上卸下盘。
    8. 加入200μl的良好混合WS2溶液到含有珠的孔中。移液器设置为200微升，轻轻吸取的整个体积上下15x连接。
    9. 传送在新的96孔板的整个体积。密封该板，并将该板在热循环仪（盖加热至100℃）。在42℃下启动热循环30分钟。
    10. Imediately放置盘上的磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。取下密封并立即丢弃所有上清液。然后，从磁底座上卸下盘。
    11. 加入200μlWS 2成含珠孔。将吸管200微升，轻轻吸取的整个体积上下15倍，避免形成气泡/泡沫。密封该板，并将该板在热循环仪（盖加热至100℃）。在42℃下启动热循环30分钟。
    12. 立即将板在磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。取下密封并立即丢弃所有上清液。然后，从磁底座上卸下盘。
    13. 加入200μl的良好混合WS3溶液到含有珠的孔中。移液器设置为200微升，轻轻吸取的整个体积上下15x连接。
    14. 将板在磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。丢弃所有上清液，并从磁性底座上卸下盘。
    15. 重复此WS3洗了第二次。
    16. 除去上清液后，密封板，并短暂离心​​拉下残留上清。在放置板磁性支架，持续2分钟。丢弃剩余的上清液。
    17. 在0.2 ml管中，混匀28.5微升ET1和1.5微升HP3解决方案。这样的搭配是1池，若再池准备，以备池的数量乘以这些卷。
    18. 从磁底座上卸下板。加入23微升上述制备的混合物。移液器设置为23微升，轻轻吸取的整个体积上下15x连接。密封该板，并留下5分钟，在室温。离心机在280 XG 1分钟，在20℃。
    19. 将板在磁性支架，持续2分钟。确保上清出现彻底清除。除去粘合膜和转移21微升上清液到新的96孔板中。
    20. 加入4微升ET2溶液到每个孔中。移液器设置为25微升，轻轻吸取的整个体积的上下10倍和密封板。
      注:该过程可以停止在这一点上与反应贮存7天，在-15℃下。如果板被冻结，启动第二杂交之前完全解冻。
  3. 第二杂交
    1. 离心盘，持续1分钟，在280 XG在20℃。除去粘合膜，并添加50μl的NCT1，10微升的CSO，与15微升的PCR级水至25μl的库。移液器设置为100微升，轻轻吸取的整个体积上下10倍。
    2. 密封该板，并离心1分钟，在280 XG在20℃。
    3. 将板在热循环仪（盖在100℃加热），然后运行程序2（ 表1）。

5，基因组DNA富集:2日，下午

  1. 开始之前
    1. 解冻ET1，ET2，SMB，WS1，WS2，WS3和HP3溶液在RT杂交洗涤。从DNA富集试剂盒，解冻PCR扩增预混含有聚合酶（TC-PMM），PCR引物鸡尾酒（PPC），和RSB的解决方案，在冰上进行PCR扩增。
  2. 第二杂交洗
    1. 按照完全相同的协议为4.2 - 1号杂交洗。
  3. PCR扩增
    1. 在新的96孔板中，混合20微升洗脱的来自步骤5.2中，将25μl的TC-PMM的，和5μl的PPC。移液器设置为50微升，轻轻吸取的整个体积上下10倍。密封该板，并离心1分钟，在280 XG在20℃。
    2. 将板在热循环仪（盖在100℃加热），然后运行程序3（ 表1）。

6，基因组DNA富集:3天

  1. 开始之前
    1. 冰解冻RSB的解决方案。至少30分钟，在使用前，使纯化的磁珠至室温。
  2. PCR纯化
    1. 离心反应板从步骤5.3，持续1分钟，在280 XG在20℃，并除去粘合剂覆盖。
    2. 在室温下，加入90微升的previously混合纯化的磁珠在每个孔中。移液器设置为140微升，轻轻吸取整个体积上下10倍。孵育15分钟，在室温。放置在96孔板上的磁性底座5分钟，在室温。确保上清出现彻底清除。
    3. 制备新鲜的80％乙醇溶液（2样品中，加入200微升的蒸馏水，以800微升乙醇）。弃去上清液，注意不要打扰颗粒。
    4. 同时使板在磁性支架，加入200微升新鲜制备的80％乙醇中，以每孔，而不会干扰珠孵育该板进行30秒，在室温。弃上清，重复此清洗一次。确保乙醇已被删除。让干燥在室温进行15分钟或直到乙醇完全蒸发，而该板是在磁性支架上。
    5. 从磁底座上卸下板，加入30微升的RSB缓冲。移液器设置为30微升，并轻轻吸取吨他整个音量上下10倍。将培养板在室温下2分钟。
    6. 放置在96孔板上的磁性支架并孵育5分钟，或直至上清液出现完全清楚。轻轻转移28微升上清液到新的96孔板（板类型:TCY）。
      注:该过程可以停止在这个阶段，并存储在-15℃下进行长达7天的反应。
  3. 库验证和定量
    1. 通过使用片段分析仪确定库的质量。高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来代替上述的步骤，但不推荐使用。片段应为150个基点至1000个基点之间。
      注:推荐:通过qPCR定量库测序过程中获得集群的最佳数量。
    2. 作为参考，使用经过验证库（2米）。如果第一个库正在准备中，使用规定的sequenc校准噬菌体PhiX的DNA（10纳米）荷兰国际集团的设备。
    3. 制备阳性对照的系列稀释液，得到7个点，20，16，8,6，4,2，和下午1点在EBT（EB洗脱缓冲液+0.1％吐温20）。淡化利益图书馆在1/1000〜1/2000。每一点必须以一式三份进行分析。
    4. 制备下列混合物（乘法卷所使用的孔的数目）:对于1个孔中，添加10微升的SYBR Green含有定量PCR主混合物（2×），0.2微升正向引物（10μM，AATGATACGGCGACCACCGAGAT），0.2微升反向引物的（10μM，CAAGCAGAAGACGGCATACGA），和7.6微升的PCR级水。
    5. 混合后，废除在96孔板中，18微升混合液到每个孔中，并加入2μl的阳性对照和文库稀释。密封该板，并离心1分钟，在280 XG在20℃。然后，把平板的定量PCR热循环和运行程序4（ 表1）。
    6. 分析结果如常规绝对量化，得到每个升的产率ibrary。定量PCR的优点是，它仅量化的DNA，将与流动池进行交互。
      注:请不要使用的DNA荧光定量由于DNA分子模拟在试剂中的一个存在。这种量化方法将高估图书馆产量，从而低估了集群得分。
  4. 排序下水
    1. 稀释每个库在4纳米的30微升的洗脱缓冲液（EB）的最终体积，并集中所有的图书馆，拌匀。
    2. 准备在EB缓冲液新鲜的0.2N的NaOH溶液，搅拌10微升该NaOH溶液与10微升汇集库。搅拌均匀，准确地孵育5分钟在室温。
    3. 5分钟后，立即加入980μL杂交液（从测序盒）拌匀。然后，混合400μL与600μL杂交液这种混合物。拌匀并注入了8转600微升到300周期盒（2×150）PM。启动顺序。

7，数据分析

  1. 一旦设备处理的数据中，.bam和.vcf文件转移到新电脑上。
    注:转座子碎片结合的脚印。因此，软件会自动修剪这些数据。
  2. 收集与所述设备分析所获得的遗传变异。
  3. 通过按照制造商的指示进行分析导出的文件（.bam，的.vcf）与另一软件（阿拉穆特）。然后，比较用两种分析中得到的遗传变异。唯一的变化检测两次都被认为存在。

表1 PCR条件

节目 温度 时间 民。重复
1 72℃ 3分钟 1
98℃ 30秒 1
98℃ 10秒 10
60℃ 30秒
72℃ 30秒
72℃ 5分钟 1
10℃ 无限
2 95℃ 10分钟 1
93℃ 1分钟 1
91℃ 1分钟 1
89℃ 1分钟 1
87℃ 1分钟 1
85°C 1分钟 1
83℃ 1分钟 1
81℃ 1分钟 1
79℃ 1分钟 1
77℃ 1分钟 1
75℃ 1分钟 1
71℃ 1分钟 1
69℃ 1分钟 1
67℃ 1分钟 1
65℃ 1分钟 1
63℃ 1分钟 1
61℃ 1分钟 1
59℃ 1分钟 1
58℃ 1分钟 16-18小时
3 98℃ 30秒 1
98℃ 10秒 10
60℃ 30秒
72℃ 30秒
72℃ 5分钟 1
10℃ 无限
4 95℃ 10分钟 1
95℃ 15秒 40
60℃ 1分钟

结果

样品QC成果

这种方法来确定靶基因的序列的能力是基于基因组DNA（ 图2A）的质量和tagmentation步骤的质量。如果tagmentation是不够（ 图2B，上图），测序将不会令人满意。如上面所提到的，tagmentation纯化后，将基因组DNA的应tagmented成片段从150 100bp到1000bp的多数大约300 bp的片段（ 图2B，下图）。

在文库制备结束，库质量是通?...

讨论

广泛使用的NGS的设备和技术已经在癌症和遗传疾病的研究提供新的机会。除了全基因组测序和RNA测序，产生大量的无数的患者选择的基因组DNA序列的分析同时提供了诊断的前景十分广阔。在这里，我们开发了使用Nextera技术，同时研究11完整的基因在24例中等通量测序装置（表材料/设备）的特定设计（随叫随到）。该协议允许快速生成的数据，使患者的错误的低风险的担忧快速反应。如示于?...

披露声明

The authors have no conflicts of interest to declare.

致谢

We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
MiSeqIlluminaSY-410-1001Sequencing/medium throughput device
Nextera Enrichment kitIlluminaFC-123-1208Transposase based technology
300 cycle cartridgeIllumina15033624
AMPure beadsBeckman CoulterA63881Magnetic purification beads
Magnetic standAlpaquaA32782
96-well PlatesLife Technologies4306737
MIDI 96-well platesBioradAB0859
Microseal ABioradMSA-5001This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment
MiSeqIlluminaProvided with the sequencing device
Experiment Manager software
Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new
Manufacturer website tool

参考文献

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92 DNA Nextera DNA BRCA1 BRCA2

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