在一个三维胶原蛋白矩阵分析细胞迁移

摘要

细胞迁移是涉及过多的生理的是，如伤口愈合和免疫反应，和病理生理过程，如癌症的生物现象。在3D胶原基质迁移试验是一种多用途的工具内的三维生理状环境分析不同类型的细胞的迁移特性。

摘要

迁移的能力，是各种细胞类型的标志，并在一些生理过程，包括胚胎发育，伤口愈合，免疫反应起着至关重要的作用。然而，细胞迁移也是使这些肿瘤细胞从原发肿瘤分离开始转移性扩散的关键机制在癌症。在过去几年内各种细胞迁移测定已开发来分析不同类型的细胞的迁移行为。因为细胞的运动器官的行为明显的二维（2D）之间的不同和三维（3D）环境中，它可以假设该被嵌入在三维环境中细胞迁移的分析将产生更显著细胞迁移数据。所描述的三维胶原蛋白基质迁移测定的优点是，细胞包埋于胶原纤维代表的细胞外基质的主要成分的一种生理三维网络。由于时间推移的视频显微镜真实细胞迁移测定，允许响应于亲洄游因子或酶抑制剂的几种迁移参数以及它们的变化的判断。各种细胞类型可以使用这种技术，包括淋巴细胞/白细胞，神经干细胞，和肿瘤细胞进行分析。同样地，还细胞簇或球状体可以在胶原基质伴随单个细胞从细胞群/球体进入胶原晶格移民的分析中被嵌入。我们的结论是3D胶原基质迁移实验是一种通用的方法来分析在一个生理的3D环境中细胞的迁移。

引言

如细胞融合（查看概述见^1,2）细胞迁移是涉及过多的生理过程，包括胚胎发育，伤口愈合和免疫反应（综述见^3）的另一生物学现象。然而，迁移的能力也是一个前提肿瘤细胞转移（综述见^3,4）。

细胞迁移是一个复杂的，而不是由多个信号转导途径的相互作用的各种配体（ 例如 ，细胞因子，趋化因子，生长因子，激素，细胞外基质组分）的受体（ 例如 ，受体酪氨酸激酶的启动指示尚未完全理解的过程，趋化因子受体，整合素）相互作用^5，最终导致肌动蛋白细胞骨架随之而来的重组与设计器和黏着物重组和整合素介导的信号^6。

为了分析细胞迁移的几种体外和体内细胞迁移测定已经开发了在过去的几十年，包括Boyden小室/ Transwell小室测定法^7，划痕试验/伤口愈合测定^8-10，三维（ 3D）胶原基质迁移实验¹¹以及活体成像/镜（综述见^12）。这些细胞迁移实验都有优点和缺点， 例如 ，关于成本和需求的设备，处理或获得的数据的可靠性。

两个Boyden小室/ Transwell小试验和划痕试验/伤口愈合测定法是容易的，低成本的和发达的测定法来测量细胞迁移的体外 ^7-10。在Boyden小室/ Transwell小室测定法的细胞接种在含插入孔（约8微米的直径）的顶部-即所谓的上隔室^7。可选的，该插入件可以涂覆有细胞外米atrix的组件， 例如 ，纤连蛋白，胶原蛋白等 ，以模仿多个生理环境。同样，内皮细胞可以生长在刀片的顶端，从而模拟内皮细胞屏障^13。在定义的时间间隔到下隔室窝藏媒体和补充剂，如生长因子和趋化因子的过程中已通过的孔的那些细胞，被用作读出，以定量细胞迁移（或外渗）。

在划痕试验/伤口愈合测定细胞接种在平板中，并生长至融合^10。在实验设置板的依赖性可以预先涂覆有细胞外基质成分，例如纤维连接蛋白。创建一个从无到有/伤口从划痕的每一侧刮细胞单层单细胞后/伤口可以迁移到了国内空白，从而填补/修复它^10。的刮伤/伤口的两侧之间的距离被确定中的时间依赖性和作为读出的单元¹⁰的迁移活性。然而，细胞增殖之间（这也可能导致划痕/伤口填充/愈合）和细胞迁移的鉴别时，建议在测定随时间推移的视频显微镜和单细胞追踪¹⁰结合。

然而，无论是Boyden小室/ Transwell小室法和划痕法/伤口愈合实验，是相当不完善有关生理状细胞环境。在Boyden小室/ Transwell小室测定细胞具有迁移穿过塑料的孔，而在划痕试验/伤口愈合测定细胞接种于一个二维的预包被的塑料板。同样地，它是公认的迁徙行为明显不同的二维和三维环境³之间。例如，成纤维细胞的三维矩阵​​粘连从特征上两个焦点和纤维状粘连不同维基质中α5β1和素αvβ3整合素，桩蛋白，其它细胞骨架成分，和粘着斑激酶¹⁴的酪氨酸磷酸化的内容。同样，电池嵌入在3D环境中也显示改变的迁徙行为^15。因此，为了更准确地分析细胞迁移的迁移测定法，建议允许测量中的三维生理或生理状环境单细胞的迁移。

活体成像/显微镜是黄金标准的3D生理范围内测量细胞的迁移。这并不只属于胞外基质-细胞相互作用，而且还对不同类型的细胞，如淋巴结¹⁷内外渗¹⁶或淋巴细胞贩卖期间肿瘤细胞和内皮细胞之间的相互作用，迄今为止，是可能的，因为改进的荧光显微镜技术，例如双光子共聚焦激光扫描显微镜，使用重要的荧光染料和转基因小鼠品系表达荧光蛋白的衍生物^12,16,17。此外，活体成像/显微镜可以与手动和自动跟踪电池¹⁸的总和。由于2光子共聚焦激光扫描显微镜的需要以及动物（和相应的转基因动物模型）然而，活体成像/显微镜是一种相当高成本的技术。

克服了boyden小室/ Transwell小室试验和划痕试验/伤口愈合测定法的局限性和分析中的三维胶原蛋白基质迁移实验被开发^11,19 3D环境中不同细胞类型的迁移。由此，迁移的细胞被嵌入在三维胶原纤维网络，其中更酷似到体内的情况。共同地，由于时间推移的视频显微镜真实细胞迁移测定允许determi国家的几迁移参数以及其响应于亲洄游因子或抑制剂的改变。各种细胞类型可以使用这种技术，包括淋巴细胞和白细胞^11,20，造血干/祖细胞^21-24，和肿瘤细胞^5,25-29进行分析。除了 ​​单个细胞也将细胞簇或球状体，可以嵌入在胶原基质伴随单个细胞从细胞团/球体进入胶原移民的分析中晶格^30,31。

该协议提供了关于一个简单但功能强大的技术分析中的3D环境的不同类型细胞的迁徙行为的概述- 体外方法产生的结果是接近的体内情况。

研究方案

1，准备迁移商会

1. 制备石蜡/凡士林（1:1）的混合和加热，直到混合物熔化。使用油漆刷和绘制2-3层的石蜡/凡士林（1:1）在玻璃载片的中间混合，根据图1B-1D。
   注意:我们使用的是普通玻璃载玻片（76 * 26 * 1.0-1.5毫米（W / D / H））
2. 迅速涂抹于载玻片上融化的石蜡/凡士林混合，以避免固化而绘制。确保石蜡/石油冻层的长度为约2-2.5厘米和0.3〜0.5厘米的宽度。石蜡/石油凝胶层的厚度应为约0.1〜0.15厘米。
3. 加盖玻片，以凝固的石蜡/凡士林混合，并用两到三个层次石蜡/凡士林混合（ 图1E，1F）密封。使用4-8迁移室为一个共同的细胞迁移实验。地方迁移室íN的机架直立位置。

2，制备胶原蛋白悬浮细胞混合的

1. 收获（ 例如 ，用0.25％胰蛋白酶/ EDTA）和计数感兴趣的细胞。将细胞重悬于含胎牛血清（FCS）的完全培养基，抗生素和建议的补充。制备4-81.5毫升反应管和含4-6×10 ⁴个细胞（细胞的总数量取决于细胞的类型来进行分析）20微升细胞悬浮液与填充到50微升用完全培养基。
   注:其它化合物（ 例如 ，生长因子，趋化因子，抑制剂等 ）被添加到细胞悬浮液。使用适当的储备溶液，使得细胞悬浮液的最终体积不超过50微升。
2. 准备452微升最终胶原蛋白悬浮液总量四细胞迁移实验。加入50μl的10×MEM（pH值5.1-5.5）和27微升7.5％的碳酸氢钠溶液（pH 9.0-9.5）到1.5 ml反应管中调匀。观察从橙黄色，以强烈的紫色（pH值9.0-9.5）溶液颜色转。加入375微升液体胶原蛋白悬浮液的10倍MEM /碳酸氢钠溶液调匀。最终的胶原悬浮液的pH值应为约7.5（由光紫颜色表示）。
   注意:检查7.5％碳酸氢钠溶液的pH值。如果pH值约7.5的地方有一个开放的盖子的碳酸氢钠溶液在恒温箱（37℃，5％CO _2）的饱和的CO _2，增加了pH值（约9.0 - 9.5）。的胶原蛋白悬浮液的细胞混合物的pH为胶原网络的稳定性是至关重要的。如果它太低了胶原格将细胞迁移实验过程中坍塌。
   注:在本协议中，使用从牛后腿液体胶原蛋白（pH值1.9-2.2）（2.9-3.3毫克/毫升的胶原蛋白，95％的胶原蛋白I型，5​​％的胶原蛋白IV型）。通过进一步的胶原蛋白晶格的制备协议的示例I型胶原，从其他来源，如猪或老鼠，给出了^32,33。不要更改使用方案的体积，因为这将改变1.67毫克/毫升的晶格最终胶原蛋白的浓度。较高或较低的胶原浓度对胶原纤维的密度和伴随细胞迁移行为³⁴在它们之间的平均距离的影响。
3. 加入100μl最后的胶原蛋白悬浮液50μl的细胞悬浮液，混匀thoroughly.The最后的胶原蛋白悬浮液（1.67毫克/毫升胶原蛋白）稍粘稠。传输的正确量（100微升），将其转移至细胞悬浮液之前吸取最终的胶原溶液一次向上和向下。
   注意:一旦胶原悬浮细胞混合物结合的10倍MEM /碳酸氢钠溶液将pH值已经改变到7.5胶原纤维立即开始聚合。
4. 传输距离日最后的胶原蛋白悬浮细胞结构ê反应管的迁移室。轻轻拍打迁移室均匀分布的胶原蛋白悬浮细胞结构的迁移室（ 图1H）的底部。将迁移室中在机架直立位置并孵育约30分钟（37℃，5％CO _2），以允许胶原纤维的聚合。
5. 请注意，聚合胶原蛋白晶格稍有混浊，但仍是浅紫色。填补迁移室与完全培养基或完全培养基与利益补充剂和密封腔迁移石蜡/凡士林混合（ 图1I，1J）。

3，录音和细胞迁移分析

本节将通过时间推移视频显微镜和细胞迁移分析人工细胞追踪介绍细胞迁移的记录。

1. 交换机上的显微镜和显微镜载物台HEA之三。调整温度至37℃。使用10倍的目标。放置迁移室在显微镜下和在视场聚焦大约50个细胞以上。
2. 采用多摄像机视频监控软件应用在延时模式记录细胞的迁移。保存细胞迁移的电影以适当的格式， 例如 ，"* .AVI"或"*。传送"。链接的细胞迁移的电影文件到含有辅助信息，如信元类型和实验条件的数据库。
   注意:我们正在录制的淋巴细胞和HSPCs使用的1:80时间推移因子，表示0.75秒中的时间推移等于实时1分钟至2小时。肿瘤细胞是缓慢移动的细胞，并用1时间推移因素因而录得至少16小时:1,800（0.5秒的延时等于实时15分钟）。
3. 分析使用适当的细胞追踪应用软件，如ImageJ的软件插件细胞迁移的电影（概述在¹⁸给出）。对于一个无偏分析是至关重要的细胞将被随机选择的不知情的细胞是否是迁移活性或没有。
   注意:我们使用的是自主研发的应用软件通过鼠标光标（这是定位于细胞核）准确地跟随移动的细胞手动跟踪每个实验至少30个细胞的路径。同时跟踪的跟踪单元的x，y坐标，根据对所用的时间推移模式是自动确定的。淋巴细胞/ HSPCs x，y坐标被确定每0.75秒（等于1分钟实时），而对于肿瘤细胞中的x，y坐标被确定每0.5秒（等于15分钟实时）。
4. 确定总每单元60 x，y坐标为典型的细胞迁移实验。这是等于1小时实时为淋巴细胞/ HSPCs和15小时实时为肿瘤细胞。 A"，"表示一个单元格并没有台湾之间移动O时间点，而"数值"表示"像素"的小区有2个时间点（ 图2A）之间移动的距离。
   注:手动电池跟踪需要一定的经验。特别是快速迁移细胞难以跟踪和不同的细胞类型展览，可能辅以因素引发了不同的迁徙行为。如果同时跟踪细胞分裂，随机选择了继续跟踪一个女儿细胞。在迁移出视线场或死亡，同时跟踪是不容忽视的，但被认为是分析细胞。

4，数据分析

1. 通过使用适当的软件应用程序， 比如 ，电子表格程序分析细胞的跟踪数据。
   1. 通过复制单元格的跟踪原始数据（ 图2A），到自行设计的电子表格模板分析细胞的跟踪数据。乘"数值"的总和，占总距离的细胞已迁移了修正系数转换"像素"为"微米"。
   2. 确定两个细胞迁移参数:运动器官的活性（相当于迁移率）和主动运动（ 图2C，2D）的时间。
   3. 确定已迁移更低超过25微米（阈值电平，以减少假阳性的细胞数）的细胞作为不移动的细胞。替换"数值"，这些细胞与"，"。
      注意:参数"运动器官的活性"（或迁移率）表示追踪细胞群的细胞的两个时间点（ 图2D）之间已经移动的百分比。 A"的数值"被定义为一个移动单元，而"，"被定义为一个不移动的细胞。参数"主动运动的时间"（时间活性）表示的总时间的细胞中再已迁移的百分比特征研到观察期（ 图2C）的时间帧。 A"的数值"表示的单元已经移动，而"，"指示的小区还没有移动。该参数被进一步用于确定未移动的细胞数。
2. 计算统计学意义，显示细胞迁移数据。
   1. 用Mann-Whitney U检验计算细胞（迁移率）的平均运动器官活动的统计显着性。考虑p值<0.05为显著。
   2. 显示细胞作为XY-图，箱线图，或为条形图图的平均运动器官的活性。显示单个细胞为基础的数据，如主动运动或速度的时间，为条形图图或柱状图。
      注:如果选择电子表格软件应用程序不包含一个箱线图或柱状图工具网上搜索应该为寻找合适的TU进行torials。

结果

所使用的三维胶原蛋白基质迁移测定结合的时间推移的视频显微镜和计算机辅助细胞跟踪允许对各种细胞的迁移参数包括基于人群的参数（ 例如 ，平均运动器官的活性）和单细胞为基础的参数的确定（ 例如 ，主动运动，速度，距离时间迁移）。所获得的细胞追踪数据集，数据处理和数据显示的一个例子示于图2中 ，一个小区的跟踪数据文件类似的表（ 图2A）。

讨论

迁移的能力，是肿瘤细胞⁴的标志。不脱离原发肿瘤分离并通过周围的结缔组织肿瘤细胞迁移将不能播种继发性病变，这是几乎所有的癌症患者死亡的主要原因的能力。因为这种关系的许多研究都集中于肿瘤细胞的迁移。这些研究的目的是新颖的目标分子和靶通路，有效地阻断肿瘤细胞的迁移，从而损害或减慢转移形成的识别。对于这样的努力可能是β-阻断剂，它已显示出抑制转移性乳腺?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica DM IL inverted microscope	Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
Petroleum jelly	local drug store
Purecol (liquid collagen)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% sodium bicarbonate solution	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use