对于波长和红/近红外光治疗对氧化应激强度的范围影响的评估方法<em&gt;在体外</em

摘要

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

摘要

红/近红外光疗法（R / NIR-LT），通过激光或发光二极管（LED）的递送，可能通过减少氧化应激改善功能和形态学效果的范围内的中枢神经系统损伤的体内 ，的。然而，在氧化应激的R / NIR-LT的作用已被证明取决于波长或辐射的强度而变化。在比较治疗参数的研究缺乏，由于缺乏能够提供多个波长或强度，适用于通过量高的体外优化研究商用设备。这个协议描述了用于递送光的技术在一定范围的波长和强度，以优化所需的一个给定的损伤模型治疗剂量。我们假设，提供光的方法，其中波长和强度参数可以很容易地被改变，可以促进确定的R / NIR-LT的最佳剂量的减少活性氧（ROS）的体外。

非相干氙光通过窄带干涉滤光片过滤，以提供不同的波长（440，550，670的中心波长和810纳米）和能量密度（8.5×10 ^-3至3.8×10 ^-1焦耳/ cm ^2）的光的向培养的细胞中。从该装置的光输出被校准以发射治疗相关，等于量子剂量的光的每个波长。检测反应性物质在谷氨酸强调与光处理的细胞，用DCFH-DA和H ₂ O ₂的敏感的荧光染料。

我们成功地在一个范围内的生理学和治疗相关的波长和强度的光传递，以暴露于谷氨酸作为CNS损伤模型的培养细胞。而R / NIR-LT在当前研究中使用没有施加由培养的细胞产生的活性氧的效果的能量密度，轻的递送方法也适用于其他SYSTEMS包括分离线粒体或多种生理上相关的器官切片培养模型，并且可以用来评估的范围内的氧化代谢的结果的措施的效果。

引言

活性氧（ROS）的所需要的各种信号转导途径和细胞代谢的正常反应，包括那些神经保护^1。然而，当内源性抗氧化机制无法控制ROS的产生，细胞可能会屈从于氧化应激^2,3。损伤后的中枢神经系统，在ROS和氧化应激的存在相关联的增加被认为在损伤^4,5的进展显着的作用。尽管用于衰减已评估氧 ​​化应激策略的广泛的数目，目前有用于以下神经外伤⁶衰减ROS产生和相关的氧化应激在临床使用中没有完全有效，临床相关抗氧化剂的策略。因此氧化应激的衰减仍是治疗介入⁷的一个重要目标。

后续的改进荷兰国际集团的R / NIR-LT已经报道了在广泛的伤害和疾病，包括减少心肌梗死面积，糖尿病期间肾和肝的并发症，视网膜变性，中枢神经系统损伤和中风^8，或许通过减少氧化应激。特别是关于CNS损伤，670nm处光的功效的临床前研究已经显示在视网膜变性^9-11，脊髓损伤^12，神经元死亡¹³的模型良好的效果。临床试验已经进行了干性年龄相关性黄斑变性和目前正在进行对于中风^14，但是这些试验的结果不出现希望的，或许是由于未能采用有效的治疗参数^15。因此，R / NIR-LT并没有被广泛采用作为在神经外伤正常临床实践的一部分，尽管是一种简单的施用，非侵入性的和相对便宜的治疗方法。障碍的临床翻译，包括缺乏CL的早知道行动规范有效的治疗方案^16,17和缺乏机制。关于光疗法目前的文献揭示了过多的变化治疗参数相对于照射源（LED或激光），波长（ 例如 ，630，670，780，810，830，880，904nm），照射总剂量（焦耳/单位面积），持续时间（曝光时间），定时（前或后损伤），治疗的频率和传递模式（脉冲或连续^）8。在研究之间的治疗参数的变化，使比较困难，已经向有关的功效持怀疑态度¹⁶贡献。

因此，R / NIR-LT的优化显然需要，与细胞培养系统能够提供必要的比较的多个变量的高通量筛选的机制。然而也有一些市售的照明系统，可以提供足够的灵活性和控制わvelength和强度进行这样的优化实验。市售的LED器件通常是不能够提供多个波长或强度，从而导致研究者使用来自不同制造商，其可以不仅在强度变化的多个LED器件，而且光发射的波长的光谱。我们已通过使用宽带氙光源透过窄带干涉滤光片过滤，从而产生范围内的波长和光的能量密度，从而允许R / NIR-LT的参数密切，精确控制解决了这一问题。

要注意的是治疗的治疗剂量由光子与photoacceptor（发色团），其中在R / NIR-LT的情况下被假定为细胞色素C氧化酶^（COX）18相互作用的数目定义是很重要的。输送光子能量随波长;意相等剂量的能量以不同的波长将是玉米珍贵的不同数量的光子的。因此，从装置发射的光被校准以发射相等数目的光子的每个所选择的波长进行测试。我们已开发了可用于递送的R / NIR-LT在一定范围的波长和强度，以细胞在体外的系统和演示来测量递送的R /对ROS产生NIR-LT在细胞经受影响的能力谷氨酸压力。

研究方案

1.光学校正:测量光输出

1. 为了制备所述光递送装置，连接宽带光源（ 例如 ，氙或钨灯），以适当的电源。定位在光源的前面的准直透镜，以产生的光的准直光束。通过液体热过滤通过的光以从光束去除大部分的热量。根据不同的应用，聚焦准直光束上的入口孔的液体光导的，这提供了更灵活的递送的光的（ 例如 ，到一个培养箱）。
2. 在液体光导的另一端，定位一个第二准直透镜，然后对干扰和中性密度滤光片的支架。检查这种安排产生光所需要的波段和强度的均匀照明的地方。
   注意:在光导和试样面的端部之间的距离可能需要根据改变必须被照亮，但面积记住作为从光导增大端部的距离，光的强度将减小。在本研究中，这个距离​​是14厘米并产生一个光束截面均匀地照射一个3x3阱区域上的96孔平板。
3. 保证从灯和相关的光学组件，杂散光无法到达的试样。
4. 放水冷却器用于液体热过滤，并确保存在通过过滤器夹套交换的水。开启灯电源并等待至少5分钟，对宽带光源来稳定。注意:使用水冷却器的需要，以防止过度加热的装置。
5. 选择的窄带干扰滤波器（通常由它们的中心波长，峰值透射率和半峰全宽（FWHM）带宽描述），以产生照明的期望的波段。注意:在目前的研究中使用的窄带干扰滤波器分别为442纳米，550纳米，671纳米和810纳米。
6. 测量由灯在平面，其中试样是在治疗过程中被定位产生的光。使用连接到一个合适的分光校准的辐射探测器（余弦集电极）测量光，根据制造商的说明使用正当性的软件。
7. 使用中性密度滤光片，直到获得所需的输出来调节光的强度。注意:在本研究中，光通过每个干涉滤光器传递的强度被调整到相等的量子输出在各四个治疗波段的。要定期检查校准，因为灯的输出如有变更，这是非常重要的。
   注:按照该装置的设置后，所述细胞是准备被照射图1是在目前的研究中使用的光传送装置的表示。

在光传输设备。画报图1.图像的光电源，氙灯住房，准直透镜，水过滤器，入口孔，液体光导，第二准直透镜，过滤器支架，处理框架和磨砂黑卡。需要注意的是窄带波长和强度的过滤器未示出。

2.细胞的制备

1. 所描述的R / NIR-LT递送方法可以适用于任何类型的细胞或体外模型系统;细胞培养等下面的说明是一般情况下，使用成熟的技术，文化嗜铬细胞瘤（PC12），穆勒（RMC1）和原发性视网膜混合细胞。
2. 此前细胞接种于光治疗和氧化应激试验，文化永生化细胞在其包含适当的补充（ 例如 ，FBS，抗生素）的T75 FLAS各自的生长介质KS，直到70-80％汇合。
3. 分离永生化细胞从T75烧瓶，使用适合于细胞类型的方法进行测试如 。，胰蛋白酶。如果需要的话，前继续进行细胞的96孔测定板的播种，涂层测定板孔用为10μg/ ml的聚-L-赖氨酸1小时（ 例如 ，对于PC12细胞）或10微克/ ml的聚-L-赖氨酸为1H随后的O / N培养用为10μg/ ml的层粘连蛋白（ 例如 ，用于混合的视网膜细胞）。
4. 离心细胞，收集适当（ 例如 ，3分钟，在405×g离心PC12细胞或在218×g离心RMC1细胞10分钟），除去上清，重悬在8ml适当的细胞培养介质。
5. 如果混合视网膜细胞将被使用，从通过酶消化（木瓜蛋白酶）P0-5新生大鼠幼仔按既定的方法¹⁹制备
6. 计数存活的细胞不包括0.4％（重量/体积）的台盼蓝染料的数量，使用血球。
7. 调整细胞密度SUCh上的细胞将是约70-80％汇合在培养24或48小时后。 （对PC12细胞的接种密度为4.0×10 ⁵个活细胞/ ml时，为RMC1细胞，它是2.5×10 ⁵个活细胞/ ml和混合视网膜细胞为8×10 ⁵个活细胞/ ml）中。加入细胞后，无论是透明的或黑色的96孔板（用于H _{2 O 2}或分别DCFH-DA分析），在100微升合适的生长培养基，使板坐在平坦表面上，在37℃，5 ％的CO _2（或其他条件都适合于特定的细胞类型）中至少24小时，以允许细胞附着。
8. 培养的细胞在适当的96孔托盘中的生长培养基，直到他们70-80％汇合（24小时为PC12和RMC1细胞，48小时混合视网膜细胞）。

3.添加谷氨酸应激到细胞

1. 准备L-谷氨酸单钠盐水合物应激0-10MM的浓度适当满成长个培养基。
2. 从细胞中除去培养基，并用PBS轻轻（PC12）或HBSS（RMC1和混合视网膜细胞）洗涤细胞3次。后洗涤后，含谷氨酸介质添加到100微升的总体积/孔。

光处理的四首剂量

1. 立即在加入谷氨酸或选择的压力源，通过将制备的光递送装置，根据细胞暴露于光处理在所期望的波长和强度。一定要改变光束的使用的依赖于波长的中性密度滤光片的既定的组合的量子输出被施用。
   注意:在当前的实验中，细胞暴露于光处理3分钟，由搁在96孔板上^37℃热垫保持体温。根据需要治疗的时间可以变化。
   1. 放置了磨砂黑卡的细胞下方，以防止光反射到邻近井在96 WEL升盘指定的其他治疗参数。
2. 如果治疗所需的时间较长的长度，添加的25mM Hepes缓冲液以维持PH值的细胞培养基或理想地，将装置和处理板的培养箱内用CO ₂浓度调节到5％的CO _2，或条件是最优对于特定的细胞类型。
3. 以下的光治疗结束后，将细胞在一个水平面上，并培育在37℃和5％的CO _2（或其他条件，最适合于细胞类型）24小时。
   注意:根据需要，如上所述R / NIR-LT的附加剂量可以施用，。

光治疗ROS和检测5.最终用量

1. 之前进行最后一轮的光处理，准备用于活性氧的检测试剂。制备的50mM柠檬酸缓冲液（pH6.0的），加入Triton X100和H ₂ O ₂的检测试剂的工作溶液（1:2:97的比例的10mM的H ₂ O _2的检测试剂原液; 10 U / ml的辣根过氧化物酶; 50mM的柠檬酸钠（pH 6.0）中）。制备DCFH-DA在100μM的在适当培养基的最终浓度。
   注意:DCFH-DA试剂PC12细胞在RPMI培养基，DCFH-DA试剂RMC1细胞是在DMEM介质。需要注意的是可商购的检测试剂具有差的敏感性，以特定的活性氧和试剂应仔细选择，以提供所需的单个应用程序中的信息。
2. 辖光治疗的细胞中，如在步骤4.1-4.1.2说明。确保在细胞被治疗的光的期望的能量密度/波长。
3. 紧接光处理，取出含有谷氨酸媒体和与适当的缓冲液洗两次（用于PC12细胞，PBS中被使用，对于RMC1细胞的HBSS时）。对细胞进行ROS测定如下:
   1. H ₂ O ₂ 试验:添加45微升的50mM柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）和5μl的Triton X100到每个孔中。轻轻摇动细胞上轨道摇床进行30秒，在37℃和5％CO ₂的15分钟。加入50微升的H ₂ O ₂的检测工作溶液孵育30分钟，在室温。使用读板器以530nm的的激发波长和480纳米的发射波长测量荧光。
   2. DCF测定:添加100微升的100μM的溶液DCFH-DA到每个孔中，并孵育30分钟，在37℃和5％的CO _2。除去含有100μM的DCFH-DA中的媒体，并与适当的缓冲液洗涤（如上所述）的两倍。加入90微升缓冲溶液和10微升的Triton X100到每个孔中，并在37℃下轻轻摇动在轨道摇床上分钟温育30秒前15。使用读板器以480纳米的激发波长和发射沃维勒测量的DCF荧光衍生ength 530nm处的。
   3. 明示的ROS值相对于剩余孔中的细胞的蛋白质浓度，使用比色试剂盒根据制造商的说明书来定量蛋白浓度，参照标准曲线来计算mg蛋白质。

结果

使用中性密度滤光片，以照射细胞的范围内的能量密度包含先前证明是有益的体内 （0.3焦耳/厘米^2）20 670nm处的光的剂量的光在670nm处的波长传送的输出进行校准。作为在光源增加前中性密度滤光片的数量，强度（W /米^2）降低，从而允许更少的光传递到目标区域。表1给出了670nm处的光的从装有一个波长滤光器，光源产生的校正数据，并包括用于ND过滤器的数量和光的作为结?...

讨论

我们已经成功地适应了精确和校准的光传输系统，以提供一种机制，用于对R / NIR-LT 在体外优化的研究。的R波长和强度的参数/ NIR-LT能够被准确有效地操纵使用这个系统。我们建立了光治疗的细胞并没有导致细胞死亡，尽管ROS没有减少在输送的波长和剂量，在测试的细胞类型。当前系统在670nm处（20.11W /米^2）实现的最大强度在过量照射的外显率的先前公布的措施到大鼠脑，其中1.17瓦...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)	Cell Biolabs	STA-342
Amplex UltraRed Reagent	Molecular Probes	A36006
300 Watt Xenon Arc Lamp	Newport Corporation	6258	Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on
USB4000-FL Fluorescence Spectrometer	Ocean Optics
CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection	Ocean Optics
200μm diameter quartz fibre optic	Ocean Optics
SpectraSuite Spectroscopy Platform	Ocean Optics
2300 EnSpire Multimode Plate Reader	Perkin Elmer
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Acute toxicity, wear gloves when handling.
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	142-47-2 (anhydrous)
Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells	American Type Culture Collection	CRL-2522
Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media	Gibco	11875-119
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin	Gibco	10082-147	Warm to 37 °C in water bath before use
Horse Serum, New Zealand origin	Gibco	16050-122	Warm to 37 °C in water bath before use
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-061	Warm to 37 °C in water bath before use
100 mM Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	Warm to 37 °C in water bath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Warm to 37 °C in water bath before use
100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140-050	Warm to 37 °C in water bath before use
Retinal Muller (rMC1) cells	University of California, San Diego
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-118	Warm to 37 °C in water bath before use
75 cm2 Flasks	BD Biosciences	B4-BE-353136
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Aliquot and store at -20 °C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-134	Warm to 37 °C in water bath before use
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Laminin Mouse Protein, Natural	Gibco	23017-015	Aliquot and store at -20 °C
1X Neurobasal Medium	Gibco	21103-049	Warm to 37 °C in water bath before use
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250-061
165U Papain	Worthington
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	W326305
Corning 96 well plates, clear bottom, black	Corning	CLS3603-48EA
Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile.	Costar	07-200-103
Seesaw Rocker	Standard lab epuipment
Centrifuge	Standard lab epuipment
Neutral Density Filter Paper (0.3)	THORLABS
442 nm Bandpass Filter	THORLABS	FL441.6-10
550 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB550-10
670 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB670-10
810 nm Bandpass Filter	THORLABS	FB810-10e
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1)	THORLABS	NE01B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2)	THORLABS	NE02B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3)	THORLABS	NE03B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5)	THORLABS	NE05B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6)	THORLABS	NE06B
Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0)	THORLABS	NE10B