对于外小泡的使用流式细胞仪分析技术

摘要

使用流式细胞仪（FCM）外囊泡（电动车）的测量许多不同的方法存在。确定最合适的方法时使用的几个方面应予以考虑。两个协议用于测量电动车使用的是单独的检测或珠为基础的方法介绍。

摘要

胞外囊泡（电动汽车）的体液中是高度地参与细胞 - 细胞通讯而有助于调节生物过程的一个不同的范围中找到的小，膜衍生的囊泡。使用流式细胞仪（FCM）电动车的分析已经非常困难，由于其体积小，缺乏积极的兴趣标记离散人口。方法EV分析，而在过去十年显着改善，仍处于进展中的工作。不幸的是，没有任何一个尺寸适合所有的协议，并确定最适当的方法使用时的几个方面必须加以考虑。这里介绍几种不同的技术来处理电动车和两个协议使用两种独立检测或珠为基础的方法分析了电动车。在一个合理的˚F这里描述将协助消除抗体聚集体在商业制剂中常见的方法中，增加信噪比，以及设置门ashion最小化检测的背景荧光。第一协议使用一个单独的检测方法，该方法是特别适合用于分析大量的临床样品中，而第二协议使用基于珠子的方式来捕获和检测小电动汽车和外来体。

引言

胞外囊泡（电动汽车）的体液中是高度地参与细胞 - 细胞通讯而有助于调节生物过程的一个不同的范围中找到的小，膜衍生的囊泡。使用流式细胞仪（FCM）电动车的分析已经非常困难，由于其体积小，缺乏积极的兴趣标记离散人口。方法EV分析，而在过去十年显着改善，仍处于进展中的工作。不幸的是，没有任何一个尺寸适合所有的协议，并确定最适当的方法使用时的几个方面必须加以考虑。这里介绍几种不同的技术来处理电动车和两个协议使用两种独立检测或珠为基础的方法分析了电动车。在一个合理的˚F这里描述将协助消除抗体聚集体在商业制剂中常见的方法中，增加信噪比，以及设置门ashion最小化检测的背景荧光。第一协议使用一个单独的检测方法，该方法是特别适合用于分析大量的临床样品中，而第二协议使用基于珠子的方式来捕获和检测小电动汽车和外来体。

电动汽车，也被称为微粒，是在参与细胞-细胞通讯而这有助于调节生物过程¹的各种各样的体液发现小，膜衍生的囊泡。通过各种表面标记物和/或生物材料直接转移表达，电动汽车能够改变受体细胞的功能发挥要么激活或抑制细胞间通讯²角色^{- 4。}在临床上，血小板衍生的电动汽车已知具有强抗凝血活性^5，而另一些已被证明有助于广泛的条件下，从促进肿瘤metasta矽统^6〜防止疾病^7。电动车可分为较小类别的细胞衍生囊泡诸如外来体和微泡（MVS），这取决于它们的尺寸和产生⁸的机制。细胞衍生的小泡的亚群的命名法继续进行的辩论^8,9的话题，但是，外来体通常被描述为小，来自内体的融合与质膜派生40至100纳米的颗粒，而MV的是大100〜1,000纳米粒子脱落质膜¹⁰的形成。这里，一般的术语"电动汽车"将被用来指所有类型的细胞外生物囊泡由细胞释放。

从全血中电动车辆的隔离是一个多步骤的过程和许多不同的处理的变量已被证明影响的EV内容，包括贮存温度和持续时间^11,12，抗凝血剂/防腐剂使用¹³和离心法使用^14。有必要对这些变量的标准化，导致血栓与止血科学和标准化委员会（SSC ISTH）进行正常的血液处理和EV隔离程序^15,16由国际协会的建议，但存在着研究人员之间的最优协议没有达成共识使用^12。然而，大多数人认为，这严格控制分析前变量是准确的和可重复的数据是至关重要的。

为了分析电动汽车中，研究人员已利用各种方法，包括透射电子显微镜^17，扫描电镜^18,19，原子力显微镜，动态光散射^20,21和蛋白质印迹^22,23。而FCM是选择用于许多研究者^9,24的方法^{- 26}由于其高吞吐量能力，使用流式细胞仪电动车辆的分析已经^{32 -}由于其规模和缺乏独立阳性群体²⁷个老大难问题。相比细胞的分析，对电动汽车的结果1）较少的荧光由于每个颗粒抗原的数量越少发射的小尺寸和后染色洗涤2）有限的可行性，这是必要的，以减少背景荧光。研究人员共同面临的挑战包括免疫球蛋白聚集^27,28和抗体²⁹的自聚集所产生的信号。此外，较长的处理时间和冗长的洗涤/分离过程中使用的许多当前的协议^33,34需要多天时间承诺来分析少量的样品，使它们小于适用于高通量应用。一些研究人员干脆放弃洗涤步骤，使传统上使用的FCM阴性对照，如荧光减一（FMO）及抗体亚型无用的准确评估BACkground荧光^30。

我们的协议处理，可以阻碍电动车的正常的FCM分析三个共同的问题:从抗体的聚集体和其它非囊泡，难以除去未结合的抗体，并且缺乏明显的阳性群体所产生的信号。此处所描述的技术将帮助消除抗体聚集体在商业制剂中常见的，增加信噪比，并以合理的方式，最大限度地减少检测的背景荧光设置栅极。两种不同的检测方法是在这里提出:在第一协议使用的各检测方法，该方法是特别适合用于分析大量的临床样品中，而第二协议使用珠为基础的方法来捕获和检测小电动汽车和外来体。

研究方案

注:以下协议已符合已执行与人类福祉所有机构，国家和国际准则。所有的人的主体样本下机构审查委员会（IRB）批准的协议，并与主体的知情同意测试。

1.方法A:个别检测方法

电动汽车的血液采样/隔离1.1）处理

1. 抽取血液从供血者/病人到使用以下2步差速离心协议含1.5毫升ACD-A液等立即适合抗凝和过程（在30分钟内最多）两个10毫升玻璃试管。
   注意:此协议将从合并〜17毫升的抽血收率约贫血小板血浆（PPP）的10毫升如果有更多的或更少的PPP是需要的，血液收集管的数量可以相应地调整。
2. 离心样品在1500×g离心在室温10分钟到等离子体从血沉棕黄层和红细胞中分离出来。转让1.2毫升等分血浆上清至1.5 ml离心管，小心不要打扰含棕黄色外套和红细胞的底层。
3. 旋转以13,000×g离心10分钟，在室温以除去血小板和大细胞碎片。小心转移PPP，留下200微升，以避免干扰颗粒，并添加在PPP到一个新的试管中。
4. 在这一点上，立即使用PPP用于分析或于1.0ml等份转移至新的1.5毫升离心管中并储存在-80℃下长达两年以后的分析（参见图1A，用于总览）。
5. 如果需要纯化的电动车进行功能试验，转印6毫升PPP协议到超速离心管中，并添加28的0.2微米过滤的磷酸盐缓冲盐水液（PBS）中。自旋用于使用配备吊桶式转子超速离心机以100,000×g离心60分钟，在RT。吸上清，重悬EV像素让在1.5ml培养基。
   注:为获得最高的重现性，血液样品应尽可能一致处理来自捐助者捐助。任何变化的EV隔离方法能显著影响检测电动车辆的数量和类型。

1.2），准备样品进行分析

注意:从这个角度上，该步骤说明高通量协议分析12个样品14标记的3板。然而，在这里可以使用的抗体的其它组合;该协议可以适于通过为那些感兴趣代建议的标记物来研究其它的EV种群。

1. 从冰箱中取出12个样品（如果储存在-80℃）和解冻，在37℃。
2. 吸取内容上下几次混合。从每个样品中取出320微升，并加入到96孔板的顶行。
   注:宽度可调多井吸管是这和整个屁股许多其他步骤非常有帮助唉，分析多个样品尤其是当一次。

1.3）染色EV样品

1. 染色前，将过滤所有抗体（ABS）以除去聚集物，这可能会导致阳性信号。
   1. 要使用在各3片的结合的抗体成使用固定角度单速离心机（〜750×g离心）在RT 2分钟分开0.22μm的离心过滤管和离心机，或直到所有的抗体混合物通过过滤器已通过和无抗体的液体保留在过滤器的表面上。每次使用前店抗体鸡尾酒在冰箱里长达两个星期，但再次过滤器。
2. 加过滤抗体混合物的合适量，以每孔在第2行（ 例如 ，在面板样品I的染色的2微升每Ab的，所以共有12微升过滤抗体鸡尾酒的是，每孔加入到行2）。请参考图1B为建议的板图的轮廓。重复这些除s至下方，如果更多的面板上运行的行（在此，加入8微升/孔的第二小组鸡尾酒到行3和11微升/孔的组III鸡尾酒至4行的是指材料清单用于特定面板信息）。
3. 使用多通道移液管，混合在PPP样品中第1行上下和从孔中第1行中的行转移100μl到井2.混合上下。变化的提示和重复，转移100μl的从第1行至行3和4孵育在4℃下进行30分钟。

1.4）洗涤MV样本

1. 除去96孔板在4℃，并转移至生物安全柜中。使用多通道移液管，添加220微升PBS /孔的行6-8（用于冲洗/清洗含有染色PPP协议的孔）。
2. 传输的每一个的内容以及使用宽度可调多管移液器（对于12个样本的预标记的离心过滤管，用3片的抗体，12×3 = 36过滤管将需要）。利用同样的技巧，从洗行取出200微升PBS，并添加到从PPP只是删除了相应的井。
3. 混合上下冲洗孔和冲洗液转移至向其中PPP的先前溶液中加入相同的过滤器。关闭顶部离心式过滤器。变化的提示。
4. 重复此过程，与剩余的染色样品，直到所有的染色样品的PPP已经转移连同它们漂洗溶液至离心过滤器。
5. 转移离心过滤器以一个固定的转子离心机和旋转，在850×g离心3分钟，在RT。
   注:确保没有液体留在过滤器顶部。离心后，将过滤器应显示为"干"的，顶部没有可见的流体层残留。而不太可能的，一定的PPP样品可能需要更长的离心时间，以有效地移动穿过所述过滤器。
6. 取下离心过滤管，并返回到生物安全柜中。使用多通道移液管，重悬过滤器的顶部在300微升PBS中。转移悬浮内容预先贴标签的试管立即FCM分析。
   注意:要保持吸液管柱塞凹陷样品间一致的力和数量，以避免样品到样品的变化是非常重要的。这最好应使用电子移液器已编程到吸管上下一个特定体积进行（ 例如 ，280微升）的每个采样时间（ 例如 ，8倍）的具体数量。

1.5），流式细胞仪设置

1. 打开FCM软件。在此之前实验设置，使用的仪器设置珠（以下制造商的说明）进行日常仪器校准和设置。
2. 如果EV样本已染色与多于一个的抗体和多个荧光染料都可以一次进行测量，计算出的补偿值如下:
   1. 加入2滴赔偿珠预标记的管（1管为每个荧光染料缀合的抗体）以及添加抗体的推荐量。添加2滴负补偿珠到另一个管作为未染色补偿控制来使用。
   2. 孵育在4℃下进行30分钟，用PBS重悬洗于400μlPBS中。
   3. 使用流式细胞仪的软件流程包括与仪器，运行每个补偿管荧光灯调整电压，将每个峰值约10 ⁴ 5数十年来规模。确保该荧光峰是最高（最亮）在其自己的信道的荧光相比，所有其它信道，并在必要时再调整的荧光参数的电压。运行每个单独染色补偿管，捕捉每管至少有5,000个事件。
   4. 选择标签"实验"，然后选择"补偿"，然后选择"计算赔偿"申请补偿值的所有样本。
3. 设置前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）的电压参数，以对数比例，并选择由流式细胞仪（FSC = 200和SSC = 200）为每个所允许的最低阈值。
4. 在运行的0.22微米过滤的PBS中的管，调整FSC和SSC电压到该排除多数的背景噪声（ 即 ，恰好低于该事件的发生率超过5个事件/秒的电压阈值）的最高值。
5. 接下来，运行含有0.2微米的管 - 1.0微米的珠子稀释在PBS中，如果必要的。在一个FCS与SSC的情节，画周围的珠子群门之间0.2微米和1.0微米捕获事件。可替代地，在一个SSC-H的直方图，画出一个门，以包括所有的事件比1.0微米小球要小。
6. 流式细胞仪的流速为"Lo"（约8-12微升/分钟）。使用珠管（或含有珠已知浓度等管）调整流式细胞仪流速盘，直到前夕NT率达到约200次/秒。读取所有样品管在相同的流速，并使用在以后的实验中相同的珠浓度，以确保流速保持运行之间是一致的。
7. 运行在PBS中稀释彩虹荧光发色粒子的管。获得5000事件。记录对FSC，SSC和每个颜色通道的平均强度值。使用这些值来调整在以后的实验中的电压，以确保荧光强度保持实验之间保持一致。

1.6）样品阅读

1. 流式细胞仪的流动速率设定为"Lo"的（约8-12微升/分钟）和运行每个样品完全1或2分钟。
2. 第一读取后，10％的加20微升NP-40的每个样品，移液器上下，并重新读取为相同量的时间（1或2分钟），以允许在检测到的阳性事件的减法在相同的时间内裂解样本。
   注:这是非常小鬼ortant该样品用吸管，而不是涡流混合。根据我们的经验，涡旋可能会导致一些抗体的自聚集，导致EV-模仿阳性事件。
3. 一旦所有样品已阅读，出口用于使用FCM分析软件进一步分析所有.fcs文件到一个单独的文件。

1.7）数据分析

1. 打开FCM分析软件。导入所有的.fcs文件到一个新的实验文件。
2. 打开珠只管。在FSC-A对SSC-A地块，周围画一个栅极之间0.2微米和1.0微米大小的所有珠子。这是EV栅极。拖动来添加到所有样品。
3. 使用裂解的样品作为阴性对照，绘制在门的背景荧光中使用的各荧光通道的边缘。拖动荧光门到每个相应的未裂解的样品的EV栅极。
   注:在这一点上也很有研究双荧光双参数图。火箭形状双阳性象限（ 见图8），特别是如果标记物是已知的，以驻留在无关的细胞类型，可指示由聚集或其它囊泡-模拟事件的假象。
4. 对于每一个荧光标记物，减去从非裂解样品中的事件数的裂解样品中的事件数。任选地，由电动车辆的总数除以该号码非裂解的EV栅内以获得％正值。

2.方法B:磁珠法

电动汽车的血液采样/隔离2.1）处理

1. 请参阅方法A（1.1节）中描述的血液处理方法。

2.2），准备样品进行分析

1. 如果需要的话，分馏PPP或超速离心电动车到外来体和微泡。加入250微升PPP或超离心电动车到0.22微米的离心过滤器，并转移到一个固定的转子离心和旋转750 Xg下在室温下2分钟。
   注:确保没有液体留在过滤器顶部。离心后，将过滤器应显示为"干"的，顶部没有可见的流体层残留。而不太可能，某些样品，可能需要稍长的离心时间为流体有效地移动穿过所述过滤器。
2. 在2ml洗未涂覆6微米的聚苯乙烯小珠（ 例如 ，负ABC珠）用2X RPMI培养基，重悬。加入6000珠子每个FACS管。阴性对照管中，单独添加400微升RPMI培养基到珠。所有其他管，加入200μlPPP或电动车超速离心（或其部分）和200微升RPMI媒体。
3. 调整所有管的终体积为400微升用培养基孵育过​​夜，在4℃在振荡器上。
4. 第二天早上，洗珠用2ml培养基。吸脱上清。
5. 用5％的牛血清白蛋白（BSA）的培养基（400微升）处理3小时，在4方框＃176; C对振动筛。
6. 用2ml培养基洗涤珠。吸并重新悬浮颗粒在100微升介质。

2.3）染色EV样品

1. 过滤所有的抗体。使用方法A中使用的相同的抗体的面板，或者如果需要的话，只要它们的荧光染料是彼此相容创建抗体的不同组合。
2. 要使用在单个面板结合的所有抗体为0.22μm的离心过滤管。离心机利用固定角单速离心2分钟，或直至所有的抗体混合物的已通过过滤器和无抗体的液体保留在过滤器的表面上。
3. 添加过滤抗体混合物适当的音量，以所有管和孵育30分钟，在4℃。
4. 用2ml的培养基，重悬在400微升的媒体上流式细胞仪洗珠并立即运行（或在同一天之内）。

2.4），流式细胞仪设置和样品阅读

1. 打开FCM软件。在此之前实验设置，使用的仪器设置珠（以下制造商的说明）进行日常仪器校准和设置。
2. 如果EV样本已染色与多于一个的抗体和多个荧光染料都可以一次进行测量，计算出的补偿值如下:
   1. 加入2滴赔偿珠预先标记的管（1管各荧光标记的抗体），并添加抗体的推荐量。添加2滴负补偿珠到另一个管作为未染色补偿控制来使用。孵育在4℃下进行30分钟，用PBS重悬洗于400μlPBS中。
   2. 用FCM软件，运行每个补偿管荧光灯调整电压将每个峰值约10 ⁴ 5数十年来规模。确保该荧光峰是最高（最亮）在其自己的信道的荧光相比，所有其它信道，并如果需要再次调整荧光参数电压。运行每个单独染色补偿管，捕捉每管至少有5,000个事件。
   3. 选择标签"实验"，然后"补偿"，然后"计算赔偿"申请补偿值的所有样本。
3. 更改FSC和SSC电压参数，登录规模和选择每个通过流式细胞仪（FSC = 200和SSC = 200）所允许的最低门槛。
4. 运行样品，门上的单珠人口和收购这个门2000的事件。出口.fcs文件。
5. 用FCM分析软件分析.fcs文件。门上的单珠。计算几何平​​均荧光强度（MFI）针对每个荧光染料和与阴性对照的MFI进行比较。

结果

图1概述了用于分离和检测用任一胎圈基法或个体的检测方法电动车辆的整体的处理方案。个别检测用流式细胞仪可以很好地用于分析较大的电动车，但大多数流式细胞仪不能够单独检测颗粒小到外来体电动车。甲珠为基础的方法，能够检测小电动汽车，但是，也有使用这种方法相关联的缺点，如表1所述。通常，使用超速离心（有或没有加入蔗糖梯度分级分离过程的...

讨论

为隔离，治疗和电动汽车的分析两种不同的协议采用两种单独的检测或珠为基础的方式呈现。选择最适当的方法来使用并不总是直截了当，需要样品的理解被测试以及感兴趣的个体的亚群。而且，用于获取细胞仪的灵敏度，必须在选择最合适的方法可以考虑。通常情况下有使用的，而是相结合的方法提供了比单独使用任何一种方法的示例的详细信息没有一个最佳的方案。理想情况下，几种不同的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR II benchtop flow cytometer	BD Biosciences		3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)
FACS Diva software	BD Biosciences		PC version 6.0
FlowJo software	Treestar US		Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5
Sphero Rainbow fluorescent particles	BD Biosciences	556298	used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency
Ultra Rainbow fluorescent particles	Spherotech	URFP-10-5	used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch
Megmix-Plus SSC beads	Biocytex	7803	used to adjust FSC and SSC  voltages to maintain  consistency  between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs
AbC Anti-Mouse Bead Kit	Life Technologies	A-10344	used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)	Santa Cruz	sc-281108	used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.
BD TruCOUNT Tubes	BD Biosciences	340334	used whenver absolute EV concentrations are needed
Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units	Millipore	UFC30GVNB	used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size
Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A	BD Biosciences	364606
Facs tubes 12x75 polystrene	BD Biosciences	352058
50 ml Reservoirs individually wrapped	Phenix	RR-50-1s
Green-Pak pipet tips - 10 µl	Rainin	GP-L10S
Green-Pak pipet tips -200 µl	Rainin	GP-L250S
Green -Pak pipet tips - 1,000 µl	Rainin	GP-L1000S
Stable Stack L300 tips presterilized	Rainin	SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer	Rainin	LA8-300XLS
96 well tissue culture plates	E&K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 Media (without Hepes)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAE001	media used for bead-based detection method
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003
Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear	BECKMAN COULTER INC	344058
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µl
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 µl
CD16 V450	BD Biosciences	560474	2 µl
CD28 FITC	biolegend	302906	2 µl
CD152 APC	BD Biosciences	555855	2 µl
CD19 A700	Biolegend	302226	2 µl
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 µl
CD62L APC	Biolegend	304810	2 µl
CD108 PE	BD Biosciences	552830	2 µl
CD235a FITC	biolegend	349104	2 µl
PANEL III
CD11b PE-Cy7	Biolegend	301322	2 µl
CD62p APC	Biolegend	304910	2 µl
CD66b PE	Biolegend	305106	2 µl
CD15 FITC	exalpha	X1496M	5 µl
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ	Biolegend	400230