自噬的分析<em&gt;产黄青霉</em&gt;通过结合使用饥饿垫荧光显微镜

摘要

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

摘要

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular ‘self-eating’) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called ‘starvation pads’ for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

引言

丝状真菌是优秀的模型系统的发育过程的研究。他们提供了几个实验的优惠，如廉价的种植，高数量的后代遗传的可访问性。最后一点是转化的允许调查迄今为止在非特异基因的各种细胞机制的重要建设特别重要的。丝状真菌是有助的几个元件和蜂窝质量控制通路像为异常蛋白，线粒体动力学的降解蛋白酶活性的机制的阐明对维持线粒体的完整性和自噬用于去除过剩和/或不正常的细胞成分和用于维持细胞活力在饥饿^1,2,3次。

有可用于自噬在丝状真菌²该研究的几个实验技术:空泡（ⅰ）调查我˚F它们含有致密的自噬体时的蛋白酶是由透射电子显微镜⁴的抑制作用，（ⅱ）自噬体通过经由荧光显微镜^5,6和（iii）检测酸化autophagosomal结 ​​构监测GFP-ATG8灶通过使用荧光染料monodansyl尸胺可视^7。

这里，一个新的增长的产黄青霉菌对自噬的研究方法。主要元素是'饥饿垫"，这只是由琼脂糖溶解在无菌自来水中的1％。另外的化合物（ 例如，压力源，清除剂，自噬调制器）可以使用，只要它们不显示自发荧光加至垫。该垫位于显微镜载玻片包含一个浅中心空腔。此衬垫在接种要么用孢子悬浮液，或以小的菌丝体片段。后者是可取的，如果所关注的菌株不能sporulatË有效（ 例如，ΔATG1株^8）。将载玻片放置在湿室（这些可以很容易地构造使用空枪头框），以防止样品的干燥和在室温下孵育。P.黄青霉能够生长在这些条件下几天。自噬可以通过显微镜液泡增大其是阳性标志物的真菌自噬被观察到。在这方面的贡献，一个P. chrysogenum菌株（威斯康星54-1255）用于形成是受它的C-末端"SKL笔顺⁹靶向过氧化物酶体绿色荧光蛋白。因此，可以监测过氧化物酶的降解。它是通过使用适当的定位信号也以标记细胞（ 例如，线粒体）的其他车厢，并分析它们的降解是可行的。虽然从数据P.黄青霉 Ws54-1255（GFP-SKL）在这里介绍，这当然是可能的使用'饥饿垫"的方法也可用于其它丝状真菌（ 例如，粗糙脉孢菌，Sordaria macrospora，曲霉菌属等 ）。

研究方案

1.准备P.的黄青霉的饥饿实验

1. 如果P.感兴趣的产黄青霉株保持对水稻（"绿色大米"），将布满菌丝孢子到1.5 ml离心管2-3米粒。它用500μlYGG（10克/升氯化钾20克/升葡萄糖，10g / l酵母氮碱，5克/升K ₂ HPO ₄ 20克/升酵母提取物）填充。
   1. 涡管30秒，使孢子可从水稻分离效率。
   2. 孵育管中1天，在室温（ 例如 ，20至25℃）。
   3. 准备一个1/50稀释这种孢子悬浮液中无菌自来水，搅拌均匀。
2. 如果P.感兴趣chrysogenum菌株被保持在琼脂平板上（ 例如 ，YGG琼脂板），转移小块菌丝到含有400微升无菌自来水和大约100毫克GL 1.5ml微量离心管屁股珠用无菌牙签或枪头。
   1. 涡管2分钟，使菌丝体变得支离破碎。立即使用该管的内容物。

为培育P. 2预备步骤黄青霉对饥饿垫

1. 接通加热板，并将其设定为约60℃。
2. 溶解2克琼脂糖在100毫升由烹调在微波炉中的溶液自来水。请注意，这个解决方案是加热后完全清楚。如果不是，再次煮直到琼脂糖完全溶解。让琼脂糖溶液冷却至约60℃，使用前。
3. 填充的1.5 ml离心管（2-4，这取决于样品的数量）用400μl无菌自来水（不添加额外的化合物），每个或400-X微升（除了x的微升在步骤2.5化合物溶液），并把它们到加热板为至少1分钟，以使笏呃内得到温暖。
4. 放置显微镜载玻片包含一个中心腔到加热板至少1分钟。
5. 琼脂加入400微升2％至1.5 ml离心管和涡简要的解决方案。在此步骤之后，如果需要的话，加入另外的化合物（ 即，1μM的雷帕霉素）。如果这样做，涡旋后短暂每个附加物质被吸向管。放管放回加热表，以防止过早固化。
   注:在离心管中的总量应该是800微升。

3.准备显微镜载玻片的含饥饿垫

1. 吸管140微升琼脂糖溶液到显微镜载玻片的腔（其仍位于加热板）。尽量避免，如果可能，气泡。
2. 立即将盖玻片上的琼脂糖溶液。
   注意:这将导致在一个平面上。
3. 把微范围滑动到实验台上大约4分钟，使琼脂糖垫巩固。
4. 小心地用拇指或食指的帮助下滑动它关闭删除琼脂糖垫盖玻片（戴手套，以避免污染！）。
5. 放置与垫显微镜载玻片成湿腔室，以防止干燥。建议:使用一个空的提示框，仍然有插入举办的枪头。加入无菌水到盒使得底部被覆盖。放置在显微镜载玻片上的插入件并关闭对话框。

4.接种饥饿垫与P.黄青霉和孵化

1. 吸移管将5μl的1/50稀释孢子（如果培养物生长在水稻）或5微升含有片段的菌丝体（如培养物生长在琼脂平板上）上饥饿垫的中心的未稀释溶液组成。
2. 关闭湿室，把它包在一个塑料袋（这作为额外的保护，防止饥饿垫干燥）。要小心，不要将箱子太大，否则接种滴会受到干扰。
3. 分析样品之前，存储在RT包装的盒子进行至少20小时。

该样品5显微分析

1. 20小时温育后，将样品准备显微镜分析;放在干燥的纸巾显微镜载玻片（底部趋于湿）。
2. 吸取小体积的水（约50微升）到饥饿垫。把盖玻片上垫挤掉多余的水分。用纸巾去除多余的水。
3. 把载玻片上的荧光显微镜的观察表。为了让菌丝生长的概述，用20倍的目标。使用63X或100X目标研究GFP的本地化的菌丝。为了防止试样的逐渐干燥不分析样品为前长于15分钟把它们放回湿室。
4. 重复5.3定期（ 例如 ，40小时和60小时生长后）。
   注:样品可以放回湿室中。这是没有必要除去盖玻片，因为它不影响菌丝生长。

结果

为了证明在P.上述过氧化物酶降解详细介绍了协议的效用chrysogenum菌株Ws54-1255（GFP-SKL）进行了分析。在这株GFP-SKL通常被导入到过氧化物酶体^9。这导致多个球形的外观，当样品通过荧光显微镜进行分析。如果发生自噬，空泡放大。 GFP-SKL成为自噬（pexophagy）并入空泡。由于这一事实，即GFP是通过液泡蛋白酶降解抗性它所标记这些细胞器^10。因此这两个参数，观察自噬（p...

讨论

这里介绍的方法允许自噬在P.方便和可重复的研究黄青霉 。例如，它可用于筛选各种化合物的功效它们是否能够调节这种真菌与否的自噬反应。雷帕霉素的研究结果表明，抑制TOR信令导致明显的诱导自噬在体育黄青霉这也被证明对其他生物体^11。

它可以使用在更复杂的显微镜（ 例如 ，共聚焦激光扫描显微镜）上生长饥饿焊盘用于分析菌丝?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope slides with central cavity	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	Diameter: 0.25 - 0.50 mm