淋巴细胞微粒和检测其促凋亡作用的气道上皮细胞产生

摘要

细胞膜棚微粒（MPS）是活性生物囊泡可以分离和它们的病理生理作用研究了各种模型。在这里，我们描述了从生成T淋巴细胞（的LMP）得出国会议员和展示他们对气道上皮细胞凋亡作用的方法。

摘要

在细胞 - 细胞通讯细胞膜衍生囊泡的生物角色的兴趣，近年来已增加。微粒（MPS）是一种这样的类型的小泡，直径范围为0.1微米至1微米，并且通常从真核细胞进行活化或凋亡的质膜棚。在这里，我们描述了从凋亡的CEM T细胞与放线菌素D的LMP是通过一个多步差速离心处理分离和表征使用流式细胞术刺激的T淋巴细胞衍生的微粒（的LMP）的生成。该协议也为展示的LMP对小鼠原发性呼吸支气管组织植源性支气管上皮细胞凋亡的作用原位细胞死亡检测方法。本文描述的方法在体外分离量的LMP丰富的淋巴细胞凋亡提供了可重复的过程。 LMP的派生以这种方式可以用来评价各种疾病模型的特征，并为药理学和毒理学试验。鉴于气道上皮提供外部环境和下面的组织之间的保护物理和功能障碍，使用支气管组织的外植体，而不是永生化上皮细胞系提供了有效的模型用于要求气道组织的调查。

引言

Microparticles (MPs) are biologically active submicron membrane vesicles released following cell activation or apoptosis. MPs are derived from both healthy and damaged cells and are implicated in many physiological and pathological processes.¹ MPs have been detected not only in human plasma, but also in inflammatory and apoptotic tissue. The biological utility of cell membrane–derived MPs has been demonstrated in various settings, including cell signalling models and as pharmacological tools.^2,3 We previously demonstrated that LMPs derived from T lymphocytes following actinomycin D stimulation (to induce apoptosis) suppress angiogenesis and inhibit endothelial cell survival and proliferation.^4,5 The antiangiogenic effects of LMPs may vary significantly depending on the stimuli used to activate T lymphocytes in vitro.⁶

The airway epithelium functions as a protective physical and functional barrier. Increased numbers of T lymphocytes in the airway can contribute to cell damage and airway inflammation.⁷ We have shown that LMPs induce apoptosis of human bronchial epithelial cells,⁸ which indicated LMPs may change barrier function of bronchial epithelium in vivo. Apoptotic cells can be identified using the TUNEL method, which detects in situ DNA fragmentation.

The overall goal of this protocol is to illustrate the in vitro production of LMPs from a T lymphocyte cell line, and to demonstrate their proapoptotic effect on airway epithelial cells. In situ cell death detection demonstrated that LMPs strongly induce airway bronchial epithelial cell death, suggesting that LMPs-mediated injury to the airway epithelium may impact barrier function of the damaged epithelium.

研究方案

注:雄性C57BL / 6小鼠（5-7周龄）从查尔斯河实验室国际公司（ST-恒，魁北克，加拿大），并根据批准的朱圣 - 海宁动物护理委员会的协议操作。小鼠支气管组织的外植体用于研究的LMP的上皮细胞上的促凋亡效应提供初级支气管上皮细胞的良好来源。这个协议描述了在体外产生的LMP的，以及用于检测对LMP的治疗支气管组织的外植体凋亡的上皮细胞的方法。该协议包括3个部分。

1.生产的LMP与表征

注意:为防止污染，确保在这个实验中使用的所有材料是无菌的或高压灭菌。执行所有的步骤，在RT在生物安全柜无菌条件下，除非另有说明。

1.1）刺激和收集的国会议员⁹

1. 解冻千万CEM T细胞等分在37℃水浴。稀释在10ml预热的无血清造血介质如X-VIVO，在15ml无菌管中并离心，在200 GX 5分钟。吸在5ml预热的培养基上清液和重悬细胞。
2. 转移细胞到T75组织培养瓶（对于悬浮细胞）用15ml预热的造血介质如X-VIVO并在湿润的培养箱中孵育4天，在37℃，5％的CO _2。
3. 4天后，转移所有的培养基和细胞分化成含有100ml新鲜培养基一个T175组织培养瓶。继续孵育细胞在相同的条件下约72小时，直到它们长到200万个细胞/ ml的密度。
4. 均匀4 T175瓶中各含有150ml新鲜培养基，并继续培养细胞直到细胞已经生长（约48小时温育），以200万/ ml的密度之间分裂的细胞。
5. 通过离心，在200×g离心收集从每个烧瓶中的细胞5分钟，并悬浮300×10 ⁶细胞到含有150ml新鲜培养基的新T175烧瓶中，以维持2000000 / ml的细胞密度。
6. 加入放线菌素D（溶解在DMSO中，在2毫克/毫升）的培养基中以0.5微克/ ml的终浓度，并培育24小时。
7. 传送所有的培养基到50ml锥形管中，并降速细胞在750×g离心5分钟。转移上清液入50ml锥形管中并离心，在1500×g离心15分钟以除去大细胞碎片。
8. 转移上清液到250ml瓶中，超速离心机在12,000×g离心50分钟。弃去上清液，并收集颗粒。
9. 洗的LMP富集粒料用40ml无菌PBS在50ml管离心12000×g离心50分钟。重复此步骤两次。
10. 收集最后一次洗涤上清液;它将被用来作为载体对照。暂停的LMP颗粒1毫升的PBS并转移到1.5毫升无菌微型管。分装和储存孤立的LMP在-80°C（避免多重自由解冻周期）。

国会议员1.2），通过流式细胞仪分析⁴表征

1. 制备2个样品的膜联蛋白缓冲液中，用1和另一无CaCl _2:的Hepes的10mM，NaCl的140mM的，加或减5毫米氯化钙_2。
2. 用0.22微米的过滤器以除去颗粒过滤膜联蛋白缓冲液和FACS流动鞘液。
3. 稀释1微升的LMP在44微升膜联蛋白缓冲液用5mM的CaCl ₂成在FACS管中。准备另一管1微升的LMP中44微升膜联蛋白缓冲液无CaCl _2（阴性对照）。
4. 添加5微升annexinV-Cy5的在每个管拌匀。孵育在室温下15分钟，在黑暗中。停止反应稀释用400μl的FACS流动鞘液在每个管中混合。
5. 加入的7微米计BEA 10微升（200,000珠）DS悬浮在每个管内标，以获得绝对计数。
6. 建立相对大小门（FSC-H，PMT E00，对数刻度）和相对粒度（SSC-H，PMT 325，对数刻度）点图上用流式细胞仪的尺寸校准荧光珠流1微米（1号门）和算珠门7微米（2号门）。
7. 分析利用已建立的门和FL-4通道的膜联蛋白FSC-H / SSC-H情节的LMP样品（PMT 765，对数刻度）点图，通过收购一个信号，直到20000计数珠在2号门的到达。
8. 确定在含有_氯化钙的膜联蛋白缓冲液的LMP的正annexinV事件，然后减去的LMP中的膜联蛋白缓冲液中的事件无CaCl _2（阴性对照）。
9. 计算根据下列方程式国会议员的绝对数量:
   

1.3）测定MP P的rotein浓度（Bradford法）

1. 制备从1.25至20微克/毫升的蛋白质标准的5系列稀释。吸移管800微升的每个标准和样品溶液注入一式两份一个干净的试管中。加入200μl布拉德福德染料试剂到每个管中。拌匀，然后在室温下孵育5分钟。
2. 测定吸光度在595nm处。确定的LMP使用标准曲线的线性回归中的蛋白质浓度。

2.支气管组织植和治疗的LMP

注:要特别注意无菌的工作​​环境，无菌准备在下面的实验中使用的解决方案和媒介。准备完全愈合中，加入1毫升组织愈合中补充与血清（解冻冰）至100毫升组织愈合中拌匀。

2.1）准备支气管组织植

1. 培养之前，划伤1厘米² 6区每个在每100mm组织培养皿用手术刀叶片的表面的边缘。涂层的每个刮擦100mm组织培养皿用2ml培养皿涂布溶液，并孵化培养皿中的潮湿_的 CO ₂培养箱中O / N在37℃。真空吸出多余的解决方案，填补了菜用15毫升组织清洗介质。
2. 根据批准的动物护理伦理委员会的协议由CO安乐死C57BL / 6小鼠（5〜7周龄_）2吸入。
3. 无菌解剖肺组织手术刀，杜蒙超细镊子和手术剪。小心地取出实质和血管。放置肺组织入冰冷的组织洗涤培养基运输到实验室，如果适用的话。
4. 进一步解剖支气管浸没在组织培养基洗涤并分离支气管直径为1到2.5mm，从外周肺组织。切片支气管组织成约5毫米厚的支气管环用手术刀。
5. 使用的无菌弯microdissecting镊子掏挖的议案，拿起支气管片段并将其放置到的菜划伤的地方。
6. 取出组织洗涤培养基，孵育所述片段在RT〜5分钟，以使它们附着在菜肴。
7. 加入10 mL完全愈合中的每道菜，并放置在一个可控气氛模块化孵化室。冲洗具有高_的 O ₂的混合气体（70％O _{2，25％N 2}和5％的CO _2，）的腔室。放置室在台式轨道培养箱，在37℃下摇晃。摇动室放置24小时以每分钟10个循环，以允许介质流间歇以上的片段。
8. 经过24小时培养后，观察在相差倒置显微镜下的组织外植体。选择支气管外植体完整，汗毛运动与活泼的支气管上皮细胞进行后续的LMP治疗。

2.2）的LMP治疗

1. 制备完全生长培养基如下:解冻生长培养基补充剂在冰上血清和成纤维细胞抑制剂。加入1毫升的生长培养基补充有血清和200μl的成纤维细胞抑制剂至100ml生长培养基;调匀。升温，在37℃的完全生长培养基在使用前10分钟。
2. 稀分离的LMP在一个新的无菌微量离心管中，用PBS以制备的LMP股票以800微克/毫升的浓度。
3. 加入0.5毫升完全生长培养基中以12孔组织培养板的各孔中。
4. 传送与从先前的协议（第2.1节），以在组织培养板的各孔的弯曲microdissecting钳子所选支气管植。
5. 适当标记培养板，以确定的LMP处理井和控制井。添加25微升的LMP库存入每个的LMP处理井（对于40微克/ ml的终浓度）和25μl的对照载体（见LMP的生产），以对照孔。
6. 继续温育在受控气氛模块化培养箱室中于37℃轻轻摇动。
7. 24小时后，洗涤外植体3次，用PBS中并继续进行下一步骤（4％多聚甲醛[PFA]的固定）。

3.组织病理学检查

3.1）准备了以下解决方案之前，进行下一个步骤

1. 通过混合137 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，10毫的Na ₂ HPO _4，1.76毫KH ₂ PO _4，pH 7.4中制备的1×PBS缓冲液中。
2. 以制备4％PFA，溶解在400ml水中，在60℃下加热搅拌20克煤灰;加入几滴10 M氢氧化钠以清除溶液。接下来添加1X PBS缓冲和调节音量到500毫升pH值至7.4。筛选和分装;储存在-20℃。
3. 准备以下脱水或补液试剂; 100％，90％，70％，50％的乙醇和二甲苯。

e_step"> 3.2）外植体固定，并组织部分脱蜡

1. 放置在一个标记的离心管中每一个外植体用1.5ml 4％的PFA和孵化O / N在4℃。与1X PBS冲洗两次植。
2. 通过醇系列脱水外植体（70％乙醇:每3次30分钟; 90％乙醇:每2次30分钟; 100％乙醇:3次每次30分钟;然后二甲苯:3次，每次20分钟，每一个）。执行在通风橱中的所有步骤，在RT。
3. 在烘箱中嵌入组织外植体中的石蜡在58℃。用旋转切片机准备5微米厚的组织切片。
4. 漂浮在56℃水浴的部分，然后装入部分标上组织幻灯片。放置在手动染色机架和干燥载玻片在65℃下1小时。允许滑动以冷却在RT。
5. 浸在含有二甲苯，每次10分钟，以去除石蜡连续4次污点菜架。浸齿条在乙醇系列以去除二甲苯:100％，然后95％，第烯80％，然后70％，然后50％乙醇（5分钟，每步）。用自来水冲洗齿条5分钟，以除去乙醇。

3.3），HE染色（H＆E）染色

1. 继续与固定的组织切片工作;齿条放入一个染色皿填充用Mayer氏苏木素15分钟。冲洗齿条用自来水以除去苏木20分钟。
2. 放置在蒸馏水中进行30 sec.Place在95％乙醇中30秒。放置在曙红Y溶液染色皿1分钟。脱水，通过对每个2分钟2的变化的95％乙醇，100％乙醇和二甲苯。
3. 在显微镜下进行快速检查，以确保剩余的曙红被除去。放置2〜3滴封固剂（费希尔SP15-100）的到每个滑动，然后盖上盖玻璃。

3.4） 原位细胞凋亡检测:TUNEL法

1. 在开始之前，请准备蛋白酶K工作液:20微克/毫升10毫米的Tris /盐酸，pH值7.4。
2. 重复步骤1至5节3.2（植固定，组织切片脱蜡）的。冲洗用去离子H ₂ O的幻灯片
3. 浸入用1×PBS的幻灯片10分钟。沥干多余的PBS。孵育组织切片30分钟，在RT下用蛋白酶K工作溶液。冲洗1X PBS滑两次。
4. 细胞死亡检测试剂盒的使用说明书中所述进行TUNEL法。安装使用安装介质中，并与盖玻片盖玻片手动。
5. 在光学显微镜下分析样品。使用图像Pro的4.5来分析细胞凋亡褐色。

结果

通过荧光激活细胞分选（FACS）分析，并使用1微米的小珠，其中国会议员（≤1微米）的97％的人膜联蛋白-V-Cy5的阳性门控的LMP进行表征与膜联蛋白V染色^10（ 图1A和1B）。通常情况下，的LMP为约2.5毫克，得到下列该协议。从C57BL支气管组织的外植体/ 6小鼠进行车辆和的LMP治疗。支气管切片的组织病理学分析揭示的LMP对支气管上皮细胞的结构完整性的影响。在对照外植体，细支气管...

讨论

国会议员是细胞间串扰活性介质和他们的研究是有希望在科学的许多领域^。11本研究中提出的体外大规模发电的LMP从凋亡T细胞系衍生的详细协议。这些国会议员表达细胞分子的大型剧目，并且生物牵连的细胞和组织稳态的调节。然而，LMP的源于不同来源可能是生物学上不同^。4,9,12,13

的LMP显示根据用于生成它们在体外刺激和从它们所衍生自的细胞?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells	ATCC	CCL-119
X-VIVO 15 medium	Cambrex, Walkersville	04-744Q
Flask T75	Sarstedt	83.1813.502
Flask T175	Sarstedt	83.1812.502
Actinomycin D	Sigma Chemical Co.	A9415-2mg
PBS	Lifetechnologies	14190-144
0.22 µm filter	Sarstedt	83.1826.001
Annexin-VCy5	BD Pharmagen	559933
FACS flow solution	BD Bio-sciences	342003
Fluorescent microbeads (1 µm)	Molecular Probes	T8880
Polysterene counting beads (7 µm)	Bangs laboratories	PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes	Falcon	352058
1 ml pipet	Fisher	13-678-11B
5 ml pipet	Falcon	357543
25 ml pipet	Ultident	DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube	Sarstedt	72.690
15 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.554.205
50 ml conical polypropylene tube	Sarstedt	62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube	Nalgene	3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle	Beckman	356011
Protein assay (Bradford assay)	Bio-Rad Laboratories	500-0006
Protein assay standard II	Bio-Rad Laboratories	500-0007
Test tube 16 x 100	VWR	47729-576
Test tube 12 x 75	Ultident	170-14100005B
Cell incubator	Mandel	Heracell 150
Low speed centrifuge	IEC	Centra8R
High speed centrifuge	Beckman	Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle	Beckman	JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube	Beckman	JA30.50
Fow cytometry	BD Bio-sciences	FACS Calibur
Spectrophotometer	Beckman	Series 600
Bronchial tissue explants and sections
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)	Charles River Laboratories, Inc.
Mouse Airway PrimaCell™ System:	CHI Scientific, Inc.	2-82001
Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades	Becton Dickinson AcuteCare	371310	#10
Scalpel Handle	Fine Science Tools Inc.	10003-12	#7
phase-contrast inverted microscope	Olympus Optical CO., LTD.	CK2
high O2 gas mixture	VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber	Billups-Rothenberg Inc.	MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker	Barnstead Lab-Line,	SHKA4000-7
12-well tissue culture plate	Becton Dickinson and Company	353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm)	Sarstedt, Inc.	83.1802
Surgical scissors	Fine Science Tools Inc.	14060-09	Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps	Fine Science Tools Inc.	11052-10
humidified CO2 incubator	Mandel Scientific Company Inc.	SVH-51023421
Histopathological examination
formalin formaldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	HT5011
paraffin	Fisher scientific  International, Inc.	T555
ethyl alcohol	Merck KGaA, Darmstadt	EX0278-1
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich, Inc.	G6403
Cacodylate	Sigma-Aldrich, Inc.	31533
microscope slides	VWR Scientific Inc.	48300-025	25x75 mm
Xylene	Fisher scientific  International, Inc.	X5-4
Mayer's hematoxylin	Sigma-Aldrich, Inc.	MHS16	Funnel with filter paper
HCl	Fisher scientific  International, Inc.	A144s-500
eosin	Sigma-Aldrich, Inc.	HT110116	Funnel with filter paper
Permount™ Mounting Medium	Thermo Fisher Scientific Inc.	SP15-100
glass coverslip	surgipath medical industries, Inc.	84503	24×24 #1
TUNEL detection kit	In Situ Cell Death Detection, POD	11 684 817 910
oven	Despatch Industries Inc.	LEB-1-20
rotary Microtome	Leica Microsystems Inc.	RM2145
filter paper	Whatman International Ltd.	1003150	#3
Microscope	Nikon Imaging Japan Inc.	E800
staining dish complete	Wheaton Industries, Inc.	900200	including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube	Sarstedt Inc.	72.69	39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath	ExpotechUSA	ORS200
phosphate buffered saline	GIBCO	14190-144
fume hood	Nicram RD Service	3707E