从大鼠的侧尾静脉血液取样

摘要

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

摘要

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

引言

从血液获得的生物标志物提供有用的诊断，预测，并分层在许多临床环境的措施，包括心血管疾病^1，癌症科学^2，和精神疾病^3。它们也可用于在基础科学评估生物的"状态"，包括饥饿，炎症，或应力存在的程度。这种措施可以通过变量，可能会或可能不会与感兴趣的问题，包括一天中所获得的样品的时间和受试者的性别临界的影响。它也可以通过在血液取样程序本身产生的应力的影响。应激激素和疼痛的感觉可迅速改变血液的组合物。

啮齿动物是最常用的实验室动物，和多种方法已经被开发用于采血。血液取样的理想方法应当具有最小的生理学对动物的影响升，无需麻醉，允许快速和反复取样，并为众多的下游应用提供足够的血量。流行的技术，用于收集血液，如颈静脉或尾尖截肢不符合这些标准的导尿。

此协议的目的是描述在大鼠中是最低限度的压力为使用一个血液采样技术，不需要麻醉，允许在单个受试者的多个血液采集，并提供了这样的多个测定可进行相对大的样本体积在单个样本。该方法的目标是获得了由急性应激反应最小的影响的血液样本。

研究方案

是用带成年雄性Long-Evans大鼠全部实验。所有的程序都按照健康（NIH）指南实验动物的护理和使用美国国家研究院​​和批准了麻省理工学院的机构动物护理和使用委员会及动物护理和使用审查办公室该USAMRMC。

1.准备

1. 通过在针放置屏蔽针在含肝素500微升管（1000 USP单位/ ml），然后抽吸和排出肝素溶液Heparinise导管和注射器。
   1. 附加蝴蝶导管注射器。保持屏蔽过导管，以保护该尖端从损坏的针。
   2. 撤回肝素的体积比的血液将被收集的体积稍大。取下注射器，并用空气填充它。
   3. 重新连接的注射器的导管，并使用空气排出体内多余的肝素液;确保只有微量残留在管，针头，和注射器。
   4. 将无菌导尿管，用还连着注射器，在无菌的表面。
2. 快速安全的老鼠在一个干净的布，确保fore-和后爪有一个舒服的姿势和呼吸不受限制。
   1. 与固定钩环带的包;确保外生殖器不收缩。
   2. 有一个助手轻轻地，坚决抑制大鼠（腹部和尾部的基地）上扎实的工作表面用尾巴挂在柜台边。

2.采血

1. 浸泡在42℃的水中尾巴40-50秒，以扩张血管，并用干纸巾的尾巴。找到尾静脉放血（同尾转动整个身体，以防止扭曲的尾巴）。
   注:尾巴的充分变暖的快速收藏品关键为n的血液试样。如果脉管收缩，导管的正确放置是困难的，并且血流量大大减少。加热垫可被用作替代水浸泡。
2. 确定的采样点。
   注意:动脉位于沿尾部的中间背侧;不要使用它进行抽样。
   1. 目标要么位于横向于动脉的左，右尾静脉。尾部，这由各个应变和随着年龄的增加色素沉着，可能会掩盖一些血管。在尾部的下部定位的静脉的一部分。
   2. 擦拭用2％氯己定的防腐溶液中的目标区域。
3. 通过抽出从零柱塞到约50微升创建在注射器和导管的负压。
4. 轻轻地紧紧握住尾巴尖端附近，以保持尾部直线整个样本采集。确保血液流动不被过度得紧闭塞。
5. 慢慢将导管插入静脉以浅角度从尾尖约5厘米。当静脉被穿透，血液将流入导管。慢慢撤回注射器的柱塞以收集在一个稳定的速率所需要的体积（〜每秒20微升）。
   1. 请教兽医人员约可收集的最大血量的信息。血应当收集的最大量取决于大鼠的体重和健康状况。别在14天时间段撤回总血量的15％以上。
      注:血液是更加困难的动物都敏锐地强调抽样集合，因为应激激素收缩血管的前几分钟，收集。例如，移动老鼠的家笼，以一种新颖的房间，需要几分钟来包装动物，或在导管的重复插入到静脉都可能引发急性应激反应。
   2. 促进布卢通过"挤奶"静脉d流。运行一个手指沿静脉的长度，从朝向尾部的末端的基础上，但仍超过2厘米从插入针或导管的尖端可以成为从静脉移位。
   3. 如果血液不能成功地从导管渗透的初始部位采集，还重新插入针上的静脉。如果收集血液在最初部位，通过断开并重新连接导管和注射器重新插入静脉前重新加压针头。在一般情况下，避免额外的穿透。
   4. 作为多个穿透可导致尾静脉塌陷，其中的血液供应的尾部被切断和软尾组织变得坏死，安乐死大鼠是否有尾静脉塌陷。
6. 当足够的样品体积被收集，通过断开和重新连接该导管释放压力的注射器。稍微吸用注射器活塞（约50＆＃181;升），并撤回从静脉针头。
   注意:如果针不首先释放压力的注射器抽出，血液滴落从针。
7. 简要施加压力插入部位止血，并用擦拭消毒液的区域。返回老鼠的笼子。

3.处理血样

1. 吸空气，以确保没有血液保持导管针内，并用剪刀剪开的导管就在上面的针。排出血液进入无菌1.5 ml离心管。
   注意:如果血液通过针推动时，所述剪切力可能导致红血细胞破裂可以与许多下游测定干扰。卸下针以避免溶血。
   1. 收集血浆，含有EDTA作为抗凝剂（这里使用管，用10微升的0.1M EDTA为200-400微升血液;确保EDTA的使用不干扰瓦特的浓度第i个下游测定）和在冰上的地方。
      1. 在冷冻离心机（4℃）内收集的10分钟10分钟旋转的全血样品在2100×g离心。洗脱的血浆，避免干扰的红，白血细胞层。
   2. 收集血清，代替样品（无抗凝血剂）在室温下长达30分钟，以使凝块。在2000×g下旋转该收集管在冷冻离心机（4℃）。血清然后可以洗脱。
2. 使用立即样品或储存在-80℃下长达一年。

结果

从作为在协议中所述的横向尾静脉采集血液的血浆给出的血浆样品，这是半透明的，并在外观淡黄色。 如图1，溶血的样品中赋予红色色彩到等离子体。急性应激反应能迅速地改变血液的组合物。例如，循环皮质酮浓度可以在应激曝光10分钟显着增加，如图2中所示。皮质酮与对应激曝光之前该方法得到的低基础水平表明，采样过程本身不是压力的显著源。

图1:样品的外观（A）溶血样品显示。离心后，将血浆或血清层（表面表示以黑色芳行）似乎略带粉红色或红色。暗色调表明溶血更高水平。 （B）的离心分离后，一个适当的收集的样品将有一个明确的，淡黄色的外观上频带（表面由黑色箭头表示），其对应于非溶血的血浆或血清。除去该层时，它不干扰底层的全血，或者通过推压枪头进入全血层或通过吸一些全血进入前端是重要的。沾染全血任何血浆或血清应该被丢弃。

图2:血浆皮质酮迅速升高承接压力的经验血从侧尾静脉成年雌性Long-Evans大鼠的所得前和10分钟，在暴露于4种色调（10秒，2千赫，85 dB为单位）共同终止。以footshocks（1秒，350微安）。血浆皮质酮基线（290.4±138.8微克/毫升）显著小于水平观察到10分钟以下介绍的电击应力的（2204.8±454.5微克/毫升，p值= 0.02中，n = 4），如通过配对t确定 - 试验。 *，P <0.05

讨论

在这里，我们描述了用于获得从大鼠其中比其它常用的技术提供显著优点的血液样品的快速和简单的程序。第一，它不需要麻醉，在与从颈静脉或眶后窦抽样对比。当被收集的血液样本周边的行为过程，麻醉剂的给药是不利的，因为它可以与学习和记忆^4,5干扰。第二，它提供了收集较大血液体积比其他静脉穿刺技术，例如收集从隐或足背静脉的能力。使用此处所描述的，技术可达1.5毫升的血可从大鼠收集在一个单一的时间点，一个容积容易允许多个测定以并行运行。最后，此过程最大限度地减少组织损伤相比，尾尖截肢或眶后出血的可能性。使用这种方法的促进符合动物W¯¯elfare法案和指南的护理和使用实验动物 ，需要尽量减少所造成的对动物进行实验过程的痛苦和困扰。

建议在调查新的这个方法练习约束和尾部出血技术，以最小化该实验动物被约束的时间。血液从约束的开始收集在不到3分钟提供最佳结果。

此处所描述的协议可被用于采样每周1至4次，但不超过每天两次以上。而反复血液采集，可以执行不同的采样点从尾的基部向上移动应用，和左，右尾静脉应交替作为采样点。啮齿动物的血液总体积是其体重的6-7％，而总血量的不超过15％应为2周的时间内进行收集。血清或等离子体包括所收集的样品体积的约40-60％。

经由侧尾静脉血液取样，也可以在小鼠所描述这里有一些小的修改进行的。首先，可以仅使用小计（27 G）的导管。其次，它是推荐使用的管限制器，而不是一个包装，以固定的小鼠。血液可从使用颌下维管束（200-500微升）的静脉穿刺的小鼠中得到的体积大于可以从尾静脉（200微升最大）被安全地收集。因为从颌下维管束采血需要最少的约束，并且可以得到更多的血液，这是对于采样在小鼠的优选途径。

与该程序可以被执行，以及它的微创性质的快速性，也由急性应激反应⁶最小化的基于血液的措施的潜在扰动。该急性应激反应可以改变许多分子的循环水平，包括白细胞介素和其它免疫活性因子^7，下丘脑-垂体-肾上腺轴⁸的激素，在交感神经系统⁹激素，生长激素释放肽^10，内源性阿片^11，多巴胺和血清素^12。如果这些分子或其他由这些分子调节的静止循环措施都需要，以减少应激反应，其内为小触发作为应激曝光开始的一分钟内是很重要的。

应激反应不仅改变血液的组合物，也代表对血液取样，因为脉管的狭窄的一个技术障碍经由从交感神经系统增加驱动器。它变得越来越难以得到从正在安装一种急性应激反应的老鼠稳定的血流量。因此，动物的痛苦必须是微量源化为了迅速得到反映感兴趣的生理状态的样品。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium heparin (1,000 USP units/ml)	Patternson Veterinary Supply	25021040010
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	JT Taylor	JT2020-01
Dermachlor rinse-chlorhexadine	Butler Schein	6356	Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate
SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters	VWR Scientific	TESV25BLK
BD Tuberculin 1 cc syringes	VWR Scientific	BD309659
1.5 ml microcentrifuge tubes	VWR Scientific	89202-682
500 μl microcentrifuge tubes	VWR Scientific	21150-330
Scissors, stainless steel, 5"	VWR Scientific	82027-586
500 ml plastic beaker	VWR Scientific	414004-149
Clean cloth wrap	Butler Schein	2993
Velcro tape, 0.75 in width	Monoprice	B004AF9II6	Hook and loop tape
Timer	VWR Scientific	62344-641