原子力显微镜成像和支持的脂质双层力谱

摘要

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

摘要

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.

The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

引言

原子力显微镜（AFM）由扫描用悬臂具有非常尖锐的端部¹产生在样品的一个区域的表面的图像。悬臂的运动探测样品的表面拓扑结构。 AFM已经广泛应用于生物分子-包括蛋白质，DNA，和膜，由于它的多功能性在分析中液体^2-5在空气中或接近天然状态固定的样品。

除了 ​​其在纳米范围内的高分辨率成像能力，原子力显微镜悬臂充当弹簧探测的相互作用力（粘附力和斥力）和样品^5,6的机械性能。这就是所谓的力谱。在这种模式下，探针先靠近样品和施加在其上的力，然后缩回，直到它失去接触与样品（ 图1A）。所产生的曲线显示力作为距离悬臂的两个应用程序的函数蟑螂和回缩。几个属性，包括弹性模量测量材料的硬度和粘合力可以得到。

支持的脂质双层的生物模型膜躺在了坚实的支撑顶部-通常是云母，硼硅玻璃，熔融石英，或氧化硅^7。他们使用的是一样的囊泡沉积的各种技术制备，朗缪尔-布洛杰特法和旋涂^8,9。原子力显微镜成像已被用来按照下列支持双层¹⁰的形成，并探测由不同的组合物^11-15的膜形成不同的结构。

执行力谱上支持双层结果的方法曲线的峰值。这表明峰值刺穿双层所需的力，被称为突破力。该双层厚度，也可以使用力曲线⁶测量。双层典型的突破力1-50之间范围NN ^6。这些特性取决于脂质填料（液体或凝胶相）和结构（酰基链长和不饱和度），并通过膜活性剂¹⁶改变。破裂背后的理论已经解释¹⁷等实验参数，如悬臂柔软度，刀尖半径和进近速度也影响了突破力^15,16,18。力光谱已被用来分析不同的脂质相^11,19，组成依赖变化^12,20，以及其它生物分子的效果，例如，肽的性质，在膜²¹的稳定性。

支持双层的平面取向是有利的原子力显微镜和其他方法，例如表面等离子共振²²和荧光显微镜^11,19组合以更好地表征结构和膜的特性。

这种详细的原始视频COL旨在利用囊泡沉积制备支持的脂质双层和他们AFM和力谱分析。虽然可以使用各种尺寸的囊泡以制备双层，该协议的重点是小的和大单层囊泡。支持双层相分离成液体下令（L _O）和液体紊乱（L _D）阶段即进行了表征^11,15。 2:1的比例将膜在2由二油酰 - 磷脂酰胆碱（DOPC），鞘磷脂（SM）和胆固醇（CHOL）的。该组合物车型脂筏，这是建议的行为作为平台蛋白质运输和分拣，细胞信号和其他细胞的过程^23,24重要。

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研究方案

1.准备支持的脂质双层^{（SLB）11,12,21}

1. 脂质混合物和多层囊泡悬浮液的制备
   1. 事先准备以下的缓冲区。
      1. 制备PBS缓冲液以2.7毫米氯化钾，浓度为1.5mM KH ₂ PO _4，8毫的Na ₂ HPO _4，和137 mM氯化钠，pH值7.2。
      2. 制备SLB（支持的脂质双层）缓冲液，在150 mM氯化钠，的10mM HEPES，pH 7.4中的浓度。
      3. 制备的1M的CaCl ₂的溶液中。
   2. 溶解在氯仿以下脂质在期望的浓度:例如，二油酰基磷脂酰胆碱（DOPC），在25毫克/毫升，鞘磷脂（SM）在25毫克/毫升和胆固醇（CHOL）以10毫克/毫升。
   3. 取18.38微升DOPC的，17.10微升的SM和11.30微升澈的，使用1mg总脂质中一个2的溶液:2:1 DOPC:缅澈的摩尔比。改变卷基础上相应的conce1.1.2制备的脂质ntrations。但是，保持的摩尔比为2:2:1 DOPC:缅澈，如改变的摩尔比将改变膜²⁵的相位特性。
   4. 通过涡旋彻底混合溶液。添加荧光染料脂质在0.05％（摩尔）如果希望通过荧光显微镜可视化的双层。
      注意:长链dialkylcarbocyanines家庭，像那样，的DiI和DIO跨越大范围的波长的，并且可以理想地用于标记脂质膜。替代地，荧光标记的脂质，如若丹明 - 磷脂或BODIPY胆固醇都可以使用。在任何情况下，染料的浓度应根据显微镜的设置被优化，同时考虑到高浓度结合到脂质的荧光团可以改变脂质的行为^19。
   5. 擦干采用N ₂气的氯仿（或任何可用的惰性气体，如Ar和He）。
   6. 此外牛逼干他的脂质混合物在真空下至少1小时。
      注意:如果存储该脂质混合物，净化空气用惰性气体（N _2，Ar或He），并在-20℃存储。分装多余的脂肪，在氯仿成小棕瓶。干燥它们以类似的方式为所述脂质混合物，置换空气用惰性气体（N _2，Ar或He），并储存在-20℃。
   7. 溶解在PBS缓冲液中的干燥脂质的10毫克/毫升的浓度。
   8. 涡大力为1分钟的混合物约20秒，以得到浑浊悬浮液，含有多层囊泡。确保没有脂质膜粘到闪烁小瓶的侧面。
   9. 发布这一悬挂成10等份微升（1毫克脂质，使10等分）。
   10. 储存在-20°C，直到进一步使用。
2. 单层囊泡的制备
   注意:各种尺寸单层囊泡的可使用超声处理法或挤压法来制备。超声使用sound能量搅拌该混合物中，并分离出多层悬浮的层。这是通过清理朦胧暂停指示。挤压迫使多层囊泡穿过膜过滤器具有确定孔径。
   1. 超声法
      1. 取10微升的多层脂质悬浮液，加入150微升SLB缓冲区。
      2. 转移混合物成小（2ml）中加帽的玻璃小瓶中并密封用Parafilm。
      3. 超声处理在室温下将混合物在水浴超声10分钟，或直至它变得清晰，得到小单层囊泡（SUV的，低于50纳米的直径）。
   2. 挤压法
      1. 取10微升的多层脂质悬浮液，加入150微升SLB缓冲区。
      2. 转移悬浮液送入低温管中。
      3. 通过浸没在低温管在液氮几秒冻结的脂质悬浮液。
      4. 解冻通过浸没在低温管在水浴中在室温下或37℃下进行数分钟的脂质悬浮液。重复冻融步骤的至少10倍。
      5. 为了挤出脂质悬浮液，使用聚碳酸酯膜具有200nm的孔的尺寸（其他孔径可用等，100纳米或400纳米）和市售挤出装置^26。
         注意:目前，有两个挤出机的设备可商购的:一个手动挤出机可用于小体积（200μl到几毫升）。在这种情况下，将样品通过膜通过手动推悬浮来回两个注射器之间挤出。根据制造商，脂质等份将需要被组合以达到设定的最高最小体积。对于更大的体积（最多50毫升）更复杂的设备用于在其中悬浮液是通过聚碳酸酯膜通过使用压缩气体被迫。设置和挤出条件可以根据国防部改变埃尔。在使用前从制造商参考说明书。这个协议是指手动挤出机为小体积。
      6. 通过在挤出机中通过水平衡的挤出机中的水。浸泡在水中的膜。
      7. 放置在膜的两个活塞之间，组装设备和平衡缓冲液中，通过使缓冲器通过挤出机，从一个针筒到另一。这个步骤允许额外地测试系统的泄漏。如果泄漏，拆卸和重新组装一遍改变膜。
      8. 取使用挤出机中的一个注射器（"脏侧"）的脂质悬浮液。
      9. 附加一个包含在一腔室中的脂质悬浮液并在相对腔室中的空的注射器的注射器。
      10. 推动注射器的一端。穿过膜并进入对置注射器的解决方案。这是第¹次传球。
      11. 通过膜传递，共计31次这样的该溶液最终的对置注射器（'干净侧"）。
          注意:检查膜挤出后。如果它被打破，则挤出过程不成功并且需要重复。
      12. 空注射器插入小管。大单层囊泡（的LUV）是稳定的1-2天，如果保存在4℃。
3. 云母和盖玻片的制备
   1. 洗涤先在水中，然后盖玻片乙醇。空气干燥。
   2. 取云母光盘和使用胶带剥离外层。
   3. 附加云母盘上盖玻片。透明的光学胶粘剂是最优这样一方面可以检查双层用荧光显微镜。
   4. 附加使用光学胶水/润滑脂塑料圆筒（2.5厘米外径，2厘米内径和0.5厘米高）。确保一切是密封的，而且没有泄漏。希望当重新使用气缸，因为它们可容易地从第超脱使用油脂Ë盖玻片和洗涤。该塑料缸的尺寸取决于AFM悬臂支架的尺寸，应作相应的调整。
4. 单层囊泡的固体沉积支持
   1. 吸管直接整个脂质体溶液涂布的云母。添加更多的SLB缓冲器达到300微升的体积。
   2. 加入0.9微升的1M氯化钙溶液，以达到3毫米的Ca ²⁺的最终浓度。
   3. 在37℃进行2分钟，然后在65℃下至少10分钟。总是覆盖缓冲区的双层。与空气和气泡接触会破坏它。如果必要的话在孵育，添加更多的缓冲液，尤其是当孵育温度较高。
      注意:孵化温度根据所需的脂质混合物和相变化。至少10分钟温育时间是必要的，以形成支承双层，但它可能是更长的时间，这取决于温度和组成。
   4. 洗用热（65℃）该双层SLB缓冲器15-20次，以去除钙和未融合的囊泡。在洗涤步骤格外小心，不断缓冲的双层轻轻吸管的清洗液，以免破坏双层。
   5. 凉爽支承双层至室温AFM测量之前。这是必要的，以形成膜的不同的阶段，以及在仪器减少热漂移。

2.原子力显微镜测量^11,12

1. 成像
   注:在接触模式或轻敲模式进行原子力显微镜成像。在溶液中的图像支持双层;不要让解决方案完全蒸发，因为这会破坏双层。作为一个将与缓冲区的工作，请遵守确保任何AFM部分由液体溢出保护的安全防范措施。
   1. 选择一个软悬臂（低于0.2牛顿/米弹簧常数决定），并安装它到t他AFM。悬臂刚度的选择是对力谱更关键（这将在后面讨论）。
   2. 安装在原子力显微镜阶段的样品，并确保所有隔振模块被接通。等待至少15分钟以达到平衡，并降低了系统的热漂移。根据AFM的设置，调整和成像规格可能不同。咨询制造商的手册。
   3. 接近与针尖接触，直到样品。
   4. 由于脂质双层通常是高度4纳米，使用Z系列的仪器，将给予最高的Z分辨率（例如1.5微米）。
   5. 选择一个地区的形象。为了获得脂质双层的概述，一个50微米×50微米或25微米×25微米的区域将是一个很好的起点，以形象。如果更小的特征出现，在较小的领域之一即可图像（10微米×10微米，或2微米×2微米）。成像区域的选择还取决于工作ř安格压电扫描器。请参考仪器手册此。
   6. 作为双层是很脆弱的，在成像过程中调整针尖的设定点，以保持在最低限度的力和正确热漂移，同时保持与样品接触。在接触模式下，最小化的设定点。在轻敲模式，最大限度的设定点。
   7. 处理图像拟合每个扫描线的多项式函数练级。对于失去与使用原子力显微镜制造公司的专有软件膜接触扫描线进行清除。
2. 力谱
   1. 校准根据制造商的协议以下的说明悬臂。校准允许光电二极管到力（ 图1B）的电信号的转换。
      1. 校准尖的灵敏度来测量偏转z-压电运动（长度单位），而不是电信号伏特。 注:AFM检测的变化在使用激光悬臂的偏转的悬臂的背部反射。激光到达光电二极管，可以在空间上探测激光点的位置。在它弯曲时与样品接触悬臂的偏转的改变是由该光电二极管为"垂直偏转"检测的，而这是在电压的单元。因为悬臂是由z-压电移动时，垂直偏转涉及在z-压电运动。垂直偏转和z运动之间的比率被称为灵敏度和转换电压的距离。
      2. 计算使用的热噪声频率的方法，通常在AFM软件中包含的悬臂弹簧常数。在该方法中，标绘出由噪音振动的振幅相对于振荡频率，产生一个功率谱密度图。该曲线将显示谐振频率附近具有峰值。该频率上的幅度我S中最大的是共振频率。适应周围的峰的洛伦兹函数由软件自动计算弹簧常数。对于热噪声方法的理论一些有用的资源列在参考文献^27-30。
   2. 成像双层的面积后，在双层选择一个5微米×5微米区域来执行力谱。
   3. 设置了原子力显微镜，以使它能力曲线在一个16×16网格区域。这将导致在每个区域256的力曲线。两个相邻点之间的间距应足够，以避免膜面积被探测由一点会与下一个点相一致。这取决于尖端半径。两点之间的100nm的距离将是理想的。除以5微米×5微米区域分为16×16格。取决于相的大小，可以选择较小的或较大的区域，然后相应地调整网格大小。
   4. 设置z-压电位移400纳米。这就决定了z-压电的运动的最大范围。它应当足够大，以确保该悬臂完全缩回远离样品在测量之间。
   5. 设置方法速度800海里/秒的速度缩回到200nm /秒。使用400之间的接近速度到6000纳米/秒取决于双层成分和脂质阶段进行研究^6,16。
   6. 设置所有参数后，收购力曲线，按AFM软件的"运行"按钮。
   7. 保存力曲线为力与高度曲线（z-压电运动的度量）。这并没有考虑到在悬臂的弯曲在与样品接触时。在数据处理步骤，在AFM软件允许校正悬臂弯曲得到力与针尖样品分离曲线（ 图1C），这将给予适当的值双层厚度。修正值在CALIBR通常掺入通货膨胀，这是保存与每个力曲线。通过在给定的点减去压电运动垂直偏转计算针尖 - 样品的分离。
      注意:在该方法的力曲线的峰值（该力值下降，即使悬臂运动仍然在方法循环）是膜的突破力，而该峰的位置和点的位置之间的差其中力开始上升再次提供了膜的厚度。
   8. 获得至少500力曲线每个条件以获得良好的统计数据。积使用像母或MatLab的方案的值的直方图，以及适合直方图高斯分布，以获得分布的峰值和宽度。

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结果

DOPC构成支持的脂质双层:缅澈（2:2:1）进行成像的原子力显微镜（ 图2的AC）。由于脂质成分，SM /澈丰富_1。·和DOPC丰富_l D同时相观察。从原子力显​​微镜成像高度轮廓可以提供在膜结构的重要信息。通过查看高度轮廓，该双层厚度可在缺陷在膜中（ 图2B），或的_Lø/ L D-相之间的高度差存在待测量可以提供。此外，AFM允许代表这些阶段具体选择区?...

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讨论

的SLBs DOPC组成:缅澈（2:2:1）中诱导氯化钙囊泡吸附和破裂后形成在云母。这种脂质成分分离为L- _D和_LØ阶段。的_1。·相位富含鞘磷脂和胆固醇，小于流体/更粘（ 图1A）比_l D同时相^11。 _1。·了由L _D相分离的表现高于周围（ 图1B，C）升高为圆形结构。该平台是由_l D同时相包围_1。·阶段。膜缺陷（或在膜...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Potassium chloride (KCl), 88%	Sigma	P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99%	AppliChem GmbH	A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, molecular biology grade	AppliChem GmbH	A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness	Duran Group	2355036
Punch and Die Set	Precision Brand Products, Inc	40105
Optical Adhesive	Norland Products, Inc.	NOA 88	Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.
[header]
Mica blocks	NSC Mica Exports Ltd.		These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease	Borer Chemie AG	Glisseal N
Liposome Extruder	Avestin	LiposoFast-Basic	As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape	3M	Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever	Bruker AFM Probes	DNP-10	Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200