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摘要

振荡是基本的网络性能和疾病和药物调节。研究脑切片振荡允许在受控条件下隔离网络的表征。提供用于制备急性脑片的CA1唤起γ振荡协议。

摘要

神经网络振荡是在健康和疾病的大脑活动的重要特征，并且可以通过一系列临床使用药物进行调制。的协议提供生成模型为研究CA1γ振荡（20 - 80赫兹）。这些γ振荡是稳定至少30分钟，取决于兴奋性和抑制性突触活动除了激活起搏器电流。 Tetanically刺激振荡具有许多重复且容易量化的特性，包括穗计数，振荡持续时间，延迟和频率时的网络状态报告。的电刺激振荡的优点包括稳定性，再现性和偶发采集使网络功能的鲁棒表征。可用于CA1γ振荡的这种模型来研究细胞机制，并系统地研究网络如何神经元活动的改变在疾病和毒品。疾病状态药理可通过使用脑切片的从转基因或介入的动物模型可容易地并入到能够选择的药物特异性靶向疾病的机制。

引言

这关联到行为状态不同频带内的脑网络的振荡出现。在啮齿类动物，海马θ振荡（5 - 10赫兹）在探索行为1,2观察，而γ振荡（20 - 80赫兹）与相关联的各种认知过程，包括感知和关注3,4。同步γ网络活动也牵连在病症如癫痫和精神分裂症5,6的病理。例如，γ振荡被认为对应于皮质癫痫病灶5,7,8的领域，并可以作为pharmacosensitivity或电阻，调查在癫痫研究9的两个重要方面的标记。

海马脑切片是已经广泛地用于研究网络活动10-12的模型。各种协议已被开发，以产生在脑切片γ振荡通常我nvolve药理调节，如低镁离子，4-氨基吡啶（4AP），荷包牡丹和红藻氨酸12-17。药理触发振荡的缺点是，他们随机出现后用药，不可靠产生或保持稳定的时间。电触发γ振荡克服许多这样的问题，也有被暂时锁定到刺激事件允许偶发记录和分析的优点。这里的协议描述为通过提供强直刺激的地层东方明珠Oriens海马切片CA1产生γ振荡。

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研究方案

在老鼠身上所有实验均批准弗洛里学院动物伦理委员会。

1.设置切削脑片

  1. 制备由（mM计）125胆碱氯，2.5氯化钾，0.4氯化钙2，6的MgCl 2，1.25的NaH 2 PO 4，26的NaHCO 3的切削液，20 D-葡萄糖饱和卡波金气（95％O 2 -5由（毫米）125氯化钠，2.5氯化钾，2-氯化钙2，2的MgCl 2，1.25的NaH 2 PO 4，26的NaHCO 3％的CO 2）和人工脑脊液（ACSF）记录溶液，10 D-葡萄糖，饱和卡波。置于冰上切割解决方案，以保持低温。
  2. 冻结大约400毫升切削溶液，并用100毫升解冻切削溶液混合在一起以创建一个冰浆。泡沫与卡波（95％O 2 -5％CO 2）以约0.5升/分钟通过小C流aliber管或烧结玻璃产生气泡的稳定，但水流平缓。
  3. 准备的250ml烧杯带有凸起尼龙筛插入在其上的大脑切片将被放置。与脑脊液填充以覆盖大约2厘米网眼和气泡与卡波金，确保气泡不会直接破坏片保持区域。同样重要的是不存在任何气泡在尼龙网，因此，如果存在的话将其删除。这将是保持室和保持在室温（20 - 25℃）。
  4. 布局解剖工具，包括一把大剪刀，一把小剪刀，小和大微铲，和大，小双钳的肃杀他们在冰上。放置在冰上vibratome组织切割块上铝箔的正方形。获得2个6厘米的滤纸，单个边缘剃刀刀片，和25毫升的烧杯中填充有切削液浆为好。
  5. 填写第二容器用冰，躺在一块组织人民行动党呃在冰面上，并放置在顶部12 cm的培养皿。填写培养皿切割液冰浆和气泡与卡波。这是在其中的大脑解剖与要执行的容器。
  6. 准备vibratome。除去新鲜双刃刀片从它的包装（用新鲜叶片每次）和喷雾用80％乙醇然后用去离子水。切有3毫升的塑料移液管在它开始锥度的点。这将被用于传送脑切片。弯曲一个27G的针在基由大约45°和附加到1ml注射器。这将用于在切割期间操作片。

2.切断脑片

  1. 麻醉鼠标（P16 - P18）用2％异氟醚或本地认可的方法。以下归纳，斩首用大剪刀的动物和拖放头进12 6cm培养皿包含冒泡切割液浆。浆料必须完全沉浸在头快速冷却。
  2. 保持头部的前部，用一只手剥离皮肤和结缔组织向前朝向鼻子。采用切开结缔组织的小剪刀，露出底层的头骨。然后取出肌肉覆盖在头骨和颈部背侧。
  3. 首先确保头骨的前部与大镊子取下头盖骨的大 ​​脑，然后通过使枕骨大孔的骨两边用小剪刀（ 图1，标记为削减A1和A2）两个横向切口。
    1. 让眼睛之间的另一个切（只是前的前囟门的）（ 图1，切标记为B），然后小心地沿矢状缝前方切反映切割颅骨部分揭示大脑（ 图1，切口标记为C）。
    2. 用小铲舀出大脑和地点到培养皿。要注意的CRAN的上，这将需要大脑的劣方面胶质神经被切断，这可以通过使用较小尺寸的微抹刀来完成。使用较大的刮刀脑转移到25毫升烧杯中填充有切削液浆料。
  4. 准备大脑半球切片。
    1. 放置一块的6厘米滤纸在一个新鲜培养皿的底部然后装满新鲜切割溶液浆和泡沫。使用较大的刮刀向下定位大脑，腹侧，到滤纸上。采取新的清洗和单边刀片和削减大脑取出小脑，然后进行沿中线切大脑分成两个半球。
  5. 准备vibratome组织块。
    1. 取冷冻vibratome组织块，表面干燥，并放置在中间一滴氰基丙烯酸酯胶和均匀地散布到大脑的近似大小。用小铲操纵之一大脑半球到大微锅铲使内侧大脑的下跌。
    2. 触摸抹刀的边缘处的第二片滤纸大脑的接口以除去尽可能多的溶液，作为可能的。滑动大脑关闭使用较小的锅铲引导它到胶水的大锅铲。
    3. 固定切割块到vibratome室并填写切削液浆和气泡室，保证了大脑完全浸入。转动切割块，使脑的腹侧朝向刀片。
  6. 切片的大脑。
    注意:每个vibratome是唯一的，从而按照制造商的说明。
    1. 设置切片厚度450微米，并确保刀片振动，因为它通过大脑移动以大约0.3mm / s的速度。通过从腹侧的皮质表面的大脑完全切断，这将产生全脑矢状切片，可以bË用于电生理记录。片会产生横向内侧到，通常3 - 4片可以从每个半球被削减。
    2. 如果切片升降机底座采用弯曲27G的针头要轻柔按片回落。由于每个切片切断，用移液管将其移动到所述平台中的保持室，其中它们是可行的长达8小时。

3.外电录音

  1. 安装在记录室中的切片。
    1. 使用移液管，将脑切片成灌注脑脊液流动在1浸入式录音室 - 2毫升/分钟，并加热至32℃。用于录像的脑脊液不同于在作为镁离子的浓度是从2毫米增加到4毫所述保持室。
    2. 固定片以"竖琴"（半圆形不锈钢带在2拉伸尼龙对面股 - 3毫米间距）。地方竖琴从而使股并行运行CA1。增加灌注速度至8 - 10ml /分钟，在32℃。
  2. 在解剖显微镜下的地方有刺激电极和CA1区（ 图2A）的辐射层的表面上的记录电极（填充有脑脊液记录溶液玻璃电极）。放置刺激电极第一然后将记录电极。
  3. 刺激谢弗络带有120 - 150微安振幅和0.1毫秒持续时间的测试脉冲，并观察所得到的场兴奋性突触后电位（fEPSP）的波形，以确定片健康（ 图2B）。的刺激和记录的电极可能需要被移动到片约50 - 从切片表面100微米获得fEPSP记录具有小纤维凌空和大振幅。该谢弗抵押品诱发fEPSPs是定型，并提供切片健康的良好指标。 Healthy片通常表现出纤维凌空fEPSP小于0.3的振幅比。
  4. 重新定位的电极。
    1. 使用解剖显微镜，移动刺激电极对地层东方明珠Oriens中间并移动记录电极的锥体细胞层尽可能靠近记录电极尽可能如图3A所示。的刺激和记录的电极可能需要大约被推入片50 - 100微米，使得fEPSP响应幅值到120 - 150微安测试脉冲约为1毫伏。
  5. 产生γ振荡。
    1. 为了产生γ振荡刺激与组织在200赫兹交付20×0.1毫秒脉冲序列。交付时，每5分钟这强直刺激可以产生可重复的响应。
  6. 使用以下记录的参数。
    1. 缩放的输出信号的增益来匹配的输入电压范围模拟到数字转换器。确保最大期望信号偏移使用最少的的输入电压范围的30％。设定收益高信号可能剪辑时要小心。需要现场录音的典型带宽为500赫兹的交流耦合在0.1赫兹，除去基线漂移。
    2. 数字化至少4 - 比低通滤波器，以避免信号混叠的拐点频率快5倍。
  7. 数据分析。
    1. 在5 Hz的高通滤波器的数据，以消除任何基线漂移。识别用衍生物阈尖峰，以最小的事件间隔为10毫秒，一个典型的事件峰值时间和7毫秒回归间隔的〜100毫伏/毫秒的阈值，和100％的分离谷。计算等待时间取为第一所识别尖峰时的刺激伪迹的结束之后发生。这种分析可以用于尖峰，延迟，事件之间的时间间隔的数量的表征，和持续时间计算为如下:
    2. 计算尖峰的数目为每振荡尖峰对于每次扫描的总数被确定。
    3. 计算振荡延迟。对于每次振荡，减去从所述刺激伪迹的端部与第一所识别尖峰的时间。
    4. 计算平均事件之间的间隔（ISI）。确定多个探测到的峰值和平均值之间的时间段。
    5. 计算振荡时间。测量每个振荡中的第一个和最后检测尖峰之间的时间。

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结果

地层东方明珠Oriens的强直刺激产生的可再生的γ振荡（35.4±2.2赫兹）， 见图3B。为了证明是本地网络CA1区CA3从投入是用弯曲32克针切割片在CA2区域内切断产生的振动。在切割片的振荡性质没有从未切割切片差异（P = 0.85;切割片6.16±1.1尖峰，每组6;未切割切片5.89±0.8尖峰，N = 6），表明该振荡机产生的。

这种方法的一个重要优点是记录的稳定性。当破伤风交付在5分钟...

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讨论

一个强大的方法来产生急性脑片CA1γ振荡描述。出现所产生的振动从本地电路能够控制和了解网络振荡12的神经生理学基础上更好的机会。 AMPA受体，GABA A受体，I H和T型Ca 2+通道所需的所有在此模型γ振荡。而这里介绍的地方CA1振荡可以产生强劲，这是依赖于确保脑片是健康的。一个关键步骤是快速去除从头骨的大脑，小心去除，然后迅速浸入冰冷的溶液中不会穿透...

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披露声明

作者什么都没有透露。

致谢

Supported by APA to RJH, NHMRC program grant 400121 to SP, and NMHRC fellowship 1005050 to SP. CAR acknowledges the support of the ARC (FT0990628) and the DOWD fellowship scheme. The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health is supported by Victorian State Government infrastructure funds.

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
4-(N-Ethyl-N-phenylamino)-1,2- dimethyl-6-(methylamino) pyrimidinium chloride (ZD7288)Sigma-AldrichZ3777
BiucullineSigma-Aldrich14340
6-cyano-7-nitroquinoxa- line-2,3-dione (CNQX)Sigma-AldrichC127
NickelSigma-Aldrich266965
CarbamazepineSigma-AldrichC4024
(2R)-amino-5-phosphonopentano-ate (APV)Tocris Bioscience0105
RetigabineChemPacific150812-12-7
Choline-ClSigma-AldrichC1879-5KG
KClSigma-AldrichP9333-500G
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638-250G
NaHCO3Sigma-AldrichS6297-250G
NaClSigma-AldrichS7653-5KG
GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
CaCl2 • 2H2OSigma-Aldrich223506-500G
MgCl2 • 6H2OSigma-AldrichM2670-500G
Electrode glassHarvard Apparatus GC150F-10
Concentric bipolar stimulating metal electrode FHCCBBPF75
Digital IsolatorGetting InstrumentsModel BJN8-9V1 
Model 1800 amplifierA-M systemsModel 1800 amplifier
DigitizerNational IntrumentsNI USB-6211
VibrotomeLeicaVT1200s

参考文献

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