协议的鲁棒抗除草剂试验在不同杂草

摘要

A robust and flexible approach to confirm herbicide resistance in weed populations is presented. This protocol allows the herbicide resistance levels to be inferred and applied to a wide range of weed species and herbicides with minor adaptations.

摘要

Robust protocols to test putative herbicide resistant weed populations at whole plant level are essential to confirm the resistance status. The presented protocols, based on whole-plant bioassays performed in a greenhouse, can be readily adapted to a wide range of weed species and herbicides through appropriate variants. Seed samples from plants that survived a field herbicide treatment are collected and stored dry at low temperature until used. Germination methods differ according to weed species and seed dormancy type. Seedlings at similar growth stage are transplanted and maintained in the greenhouse under appropriate conditions until plants have reached the right growth stage for herbicide treatment. Accuracy is required to prepare the herbicide solution to avoid unverifiable mistakes. Other critical steps such as the application volume and spray speed are also evaluated. The advantages of this protocol, compared to others based on whole plant bioassays using one herbicide dose, are related to the higher reliability and the possibility of inferring the resistance level. Quicker and less expensive in vivo or in vitro diagnostic screening tests have been proposed (Petri dish bioassays, spectrophotometric tests), but they provide only qualitative information and their widespread use is hindered by the laborious set-up that some species may require. For routine resistance testing, the proposed whole plant bioassay can be applied at only one herbicide dose, so reducing the costs.

引言

除草剂是最广泛使用的杂草控制措施，占全球植物保护市场¹高达50％。他们是相对便宜的工具，避免劳动密集和费时的土壤耕作活动，并最终导致成本效益，安全和有利可图的粮食生产^2。然而，巨大的物候和遗传变异存在于许多杂草，对除草剂的使用过度依赖在一起，经常导致抗除草剂杂草种群的选择。选择性除草剂的一个非常具体的目标代谢引进^3-5急剧增加的阻力案件的数量多年来。到目前为止，世界各地的240种杂草（双子叶植物140和100单子叶植物）产生了抗性行动^（SOA）4不同的除草剂站点。这是一个大问题杂草管理，更一般的可持续作物生产。

e_content">早检测电阻的基础上，可靠的试验，在温室中频繁地进行，是管理除草剂抗性杂草的关键步骤。根据该目标，精度，时间和可利用的资源所需的水平不同的方法已被开发，如以及考虑^6-12的杂草种类。然而，当确认一个新的杂草生物型的电阻状态是必需的（ 即，一组个人共享几个生理特征，包括生存属于一种或多种除草剂的能力在通常将控制它们的剂量用于特定基），一个强大的整株植物生物测定需要在受控环境^4,11进行。

一个生物型是刚刚一种除草剂抗性很少。因此，每个生物型的特征在于一定的阻力图案，SOA的即，数量和类型的除草剂是抗性，并且由给定的阻力级别每个除草剂^13。早期的和可靠的决心交叉或多重耐药⁵的格局^，14是现场管理性的重要。

值得一提的是，抗除草剂无关与自然容忍对某些除草剂， 例如，双子叶植物与ACC酶抑制除草剂，单子叶植物与2,4-D， 问荆对一些杂草展览草甘膦。

本文提出了一种可靠的方法来测试假定采样除草剂在控制通过除草剂​​（S）差已经报道领域耐生物型。相关的变体，以相对于所涉及的杂草种类的标准协议被提出。在仅使用一种除草剂剂量¹⁵或治疗种子在培养皿⁸根据任一整株植物生物测定法替代的技术/协议的优点都涉及到更高reliability和推断，因为在实验中列入两个除草剂剂量的阻力水平的可能性。然而，对于常规的电阻测试中，相同的方法可以在仅一种除草剂剂量施加，所以降低了成本。

以及允许确认电阻状态的，可以同时用于优化下面研究步骤和/或制定完善的抗性管理策略获得的信息。

研究方案

1.种子取样和存储

1. 监视不合理的除草剂表现不佳耕地， 即不因不利的气候条件或低质量的除草剂处理。
2. 收集来自一个物种的种子样品的时间和分配一个唯一的代码。成熟的种子通常是前收割从幸存的除草剂处理（S）的植物收集。及时监测，观察，如果种子是由母厂棚成熟时。
3. 在每个样品填表说明分配的唯一代码在赛季中使用的物质，收集日期，GPS坐标，直辖市，农民的名字，字段的大小，为患水平，作物，除草剂（S）和外地的历史记录，名称。
4. 从至少30随机选择的植物是代表励磁为患收集种子。保证种子样品含有至少5000成熟种子。对于专异交杂草（ 例如，黑麦草属物种或苋属），降低植物的编号，以10-15，保持种子的总数大约5000 ^11。
5. 子样的领域，如果杂草补丁分散在大面积（超过一公顷），为不同的抗除草剂的生物型选择。
6. 商店的种子在标记有分配唯一码启封纸袋。
7. 让水分蒸发，但不暴露的种子在高温（ 即，避免在阳光下让他们在汽车）或极端温度波动，避免感应二次休眠。
8. 清洁（除去谷壳，脱船体种子等 ）和它们在环境温度下储存在干燥的房间。在进行第一电阻测试后，储存的种子的时间在暗室中长时间在4℃下，优选在真空密封的塑料袋。这样的种子保存其活力的显著更长的时间。

2。种子休眠解除

注:种子休眠提供了一个灵活，高效的机制，使杂草适应，坚持农业生态系统。打破休眠，允许种子萌发，不同的协议具有取决于杂草种类， 即，休眠¹⁶的类型中使用。
主要有三种方式来删除休眠:

1. 春化
   注:要获得同时萌发和出苗，一期的种子春化从几天到一个星期需要从许多物种中删除生理休眠:例如，反枝苋 ， 藜 ， 黑麦草属，野燕麦，蓼，虉paradoxa的 ^17-19。需要长达15天周期较长的虞美人 ， 异型莎草和Ammania红花和长达30天的水毛花 20。
   1. 把一些去离子水的塑料菜。切滤纸两层浸泡在水中，去除多余的。放置风干种子上的文件内。转移的塑料菜冰箱，在4℃的时间所需的时间。
2. 乱刺
   注:某些杂草种类较多顽抗萌发比别人因机械休眠， 即种皮的特点，并需要使用用硫酸化学划痕的发芽^21。
   1. 制备用浓硫酸（95-98％）的烧杯中。准备一个装满水的烧杯中。把种子中的非织造织物的信封。
   2. 浸泡例如，稗属物种或假高粱种子20分钟或5分钟，分别在浓硫酸。
   3. 就拿出来信封使用镊子的烧杯中，并把它放在烧杯中装满了水。打开信封，把种子小漏勺冲洗一下彻底的在流水下。
   词:A.苡菜类需要一个不同的协议^22，23
   1. 浸泡的种子在氯仿2分钟。冲洗种子用去离子水中，并用吸水纸干燥。扣篮的种子在80％硫酸进行5分钟。
   2. 把种子在一个小漏勺冲洗一下彻底的在流水下。
3. 收获后的种子成熟
   注:其他杂草种子成熟后，不发芽，在所有的几个月，无论用来打破休眠的方法。
   1. 存储的种子的期间中的至少3-4个月在RT和低湿度，然后按照对打破休眠（ 例如，水稻变种山毛榉或P.虞美人 ）上述协议。

3，种子发芽

1. 地方种子在PLAS发芽含0.6％（M / V）琼脂硝酸钾0.1％（KNO _3）TIC菜补充说:
   1. 使用去离子水制备的琼脂的溶液在0.6％+ 0.1％的KNO _3。溶解在微波炉中的琼脂上。
   2. 倒入琼脂溶液倒入塑料菜。冷却该基材上，然后放于种子。
   变体:土壤，也可以用来作为在塑料盘中的基板。这种做法是对稗属特别有效，S.假高粱和黑麦草属。
2. 将塑料菜在柜子发芽大约一个星期取决于每个杂草的最佳条件光照和温度条件。对于大多数冬季品种，温度范围为15/25℃，夜晚/白天和12小时光照与霓虹灯管提供15-30微摩尔米^-2秒^-1的光合光子通量密度（PPFD）。对于许多夏天物种，所述温度范围为15/30℃，夜/日。
   变种:•青梅物种，如S.假高粱，需要进行热处理。在划痕后，因此，种子S.在发芽柜4小时的周期在45℃和20小时，在24℃，3天，然后三天正常条件: 假高粱经受以下条件。

4.育苗移栽和生长

1. 移植十五到二十苗放入盛有标准的盆栽混合塑料托盘（325 x 265 x95毫米）（60％粉质壤土，15％的沙子，15％agriperlite和10％的泥炭 - 以体积计）。
   注:不是直接播种移栽，允许获得在同一生长阶段的统一立场的植物，这是一个重要的先决条件，以优化除草剂处理的性能。
2. 识别每个托盘的条形码在内的所有信息的唯一识别:人口代码，除草剂被测试，复制数量和渐进盘号<。/ LI>
3. 地方托盘中，以维持所述衬底处或附近田间持水量加热温室和水的植物。
   注:根据杂草种类的生长温度变化。通常测试期间秋/冬/春完成，所以光用400瓦的金属卤化物灯，它提供了约150微摩尔米^-2秒的PPFD ^-1和12小时光照^24，19，夏季杂草与补充的C ₄光合周期通常需要更高的光强度，因此测试完成在春末，夏季或补充光照强度约400微摩尔米^-2秒^-1用14小时光照。
4. 使用不同的协议进行一些杂草为害水稻， 例如，A。苡菜类，S松材线虫和C.异型莎草在²²描述。
   1. 移植苗成聚苯乙烯托盘24的圆形细胞（55毫米直径64毫米深）FIL导致用60％粉质壤土，30％沙子，10％泥炭（体积）。
   2. 深集塑料容器装满水和固定的向下拧不锈钢棒，以防止它们飘浮（ 图1）12厘米托盘。
   3. 保持在容器中的水位在1-2厘米以下的土壤表面的水平，并添加1.5克硫酸铜到每个容器（其含有10-12升水），以避免藻类的增殖。

5.除草剂处理

1. 治疗用芽前除草剂:
   1. 后在发芽柜约三天如第3描述的，移植的发芽种子成塑料托盘含有上述基板和覆盖一层土（约1厘米）。这是为了确保苗不会由于杀草效果，而不是过大的埋藏深度出现的一个关键步骤。
   2. 就拿基板领域卡帕城市放置托盘，里面有几个洞的底部，碟子上装满了水。
   3. 移栽后一天，把托盘与芽前除草剂^25。
   4. 保持在衬底处或附近田间持水量通过既从上面和下面通过从飞碟毛细需要加水。此过程有利于除草剂的永久性在适当的深度（ 即，这里的发芽种子是）有一个良好的治疗效果。
2. 治疗用苗后除草剂:
   1. 喷塑厂当他们达到2-3叶期（ 即成长阶段扩展BBCH规模增长²⁶ 12-13）。
   2. 治疗后，从那天起，根据杂草种类的季节（ 比如，稗属水的要求和灌溉系统。它提供水3分钟，每天4次，每隔一定时间从上午9点到9 PM）。水是DIS张焕春使用自动喷灌系统。
      词:草甘膦工厂在现阶段BBCH 14-21应用。
3. 除草剂编写和分发。
   注:所有除草剂（前和出苗后）是在两个剂量施加作为商业制剂与推荐的表面活性剂，推荐字段剂量​​（1x）和三倍（3×）。
   1. 如果需要的话，根据标签指示准备在本体表面活性剂溶液;最终浓度通常表示为最终体积的百分比（ 例如，0.3％）或作为卷到每单位面积（ 例如，1升公顷^-1）进行分发。
   2. 使用以表面活性剂溶液为溶剂的除草剂（溶质）溶液，以保持活性成分的权利浓度。首先准备最集中的除草剂溶液（3次）。计算溶解在表面活性剂溶液的商业产品的数量（或在去离子水，如果一个使用下列公式的表面活性剂是没有必要的）:
      浓度_中药 = [（剂量_域x剂量_最大 ）x垂直_尾翼 ] / V _德尔
      其中:剂量_草本植物 =除草剂剂量（毫升），剂量_字段 =除草剂字段剂量（毫升公顷^-1），剂量_最大 =最大剂量递送，V _鳍 =的溶液（L）的最终体积，V _德尔 =体积由输送替补喷雾器（L公顷^-1）。
   3. 稀释（2:1，体积/体积）的除草剂溶液3倍以制备的浓度最低的一（1×）。此过程减少了称重或吹打除草剂时犯错的机会。除草剂溶液浓度表示为体积要的每单位面积（L公顷^-1）分布。
   4. 开始与下部除草剂剂量（1×）处理的序列。以这种方式，没有必要用相同的除草剂两种治疗之间洗喷涂柜。
   5. 分发除草剂搜索解决方案N使用一个精密台喷雾器递送300微升公顷^{-1（±1％），}在215千帕压力下，为0.75m秒^-1的速度，用装有三个平帆（扩展范围）液压喷嘴悬臂。
   6. 洗喷涂柜两次时，除草剂使用漂白剂的1％变化（体积/体积）中，然后冲洗干净。
      变体:草甘膦施加的200升公顷^{-1 27}的喷雾体积。
      注:特别注意有高度时，除草剂的生物，如磺脲类或嘧磺隆flazasulfuron，用于支付。在后一种情况下做一次洗涤用漂白溶液和另一用氨（2.5％体积/体积）中，然后仔细用清水冲洗。

6.收集和数据分析

1. 通过条形码阅读器，它自动地识别每个纸盒，记录植物存活的治疗以及视觉估计生物量（VEB）的数量。植物是屁股ESSED作为死了，如果他们没有表现出积极的增长无论颜色还是外观等的。
   1. 使后三或四周治疗（WAT）的评估取决于所测试的除草剂（ 例如，三WAT为ACC酶抑制剂和四个WAT为ALS抑制剂或草甘膦）。
   2. 通过包括易感人群（检查S）在所有实验， 即收集在一个网站，是从来没有或很少与除草剂处理人口评估的一般治疗效果。
   3. 明示植物存活处理的植物的数量的百分比，计算正好在除草剂处理前，并计算每平均值的标准误（SE）（指的是两次重复的值）。
   4. 对VEB通过植物生物量的视觉比较所得之间处理和不处理的检查相同的人口^25，28的一个得分，范围从10不受除草剂（与未治疗的检查相比）植物为0什么时候植物显然是死的，给予每个处理托盘。
2. 归因于种群基于从处理用两个除草剂剂量获得的结果四类:S当植物小于5％存活的除草剂剂量1×，SR时幸存者从5％到20％的除草剂剂量1×中，R的情况相比更植物的20％存活的除草剂剂量1x和RR时幸存者在除草剂剂量1×20％以上，并在除草剂剂量^3×17的10％以上。

结果

为了评估推定抗性群体的电阻状态，这是基本的，以包括在测定中的易感检查以便核实除草剂效力。的筛选试验上进行P.结果虞美人种群，杂草为害麦田，报告于图2中，其中的上易感检查（09-36），并在可疑的抗性酮（10-91）4芽后除草剂的效力呈现。人口09-36完全被ALS抑制剂受控iodosulfuron而只有一个植物存活测试，florasulam和苯磺隆（ 图2）的另两个的ALS除草?...

讨论

内协议的几个步骤是抗除草剂的人口的成功关键评估:1）种子应当收集成熟时从幸存的除草剂处理（S）的植物。在母株的种子成熟是至关重要的，以避免在种子发芽后的困难; 2）种子的存放建议避免霉菌，防止发芽的扩散; 3）苗应在合适的生长阶段来处理，所报告的除草剂包装的标签上。必须小心，使得所处理的植物已经大致达到相同的生长阶段; 4）将除草剂溶液应准备并准确处理，以便苗用的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paper bags	Celcar SAS
Plastic dishes	ISI plast S.p.A.	SO600	Transparent plastic
Sulfuric acid 95-98%	Sigma-Aldrich	320501
Non-woven fabric	Carretta Tessitura	Art.TNT17	Weight 17 g m-2
Chloroform >99.5%	Sigma-Aldrich	C2432
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Potassium nitrate >99.0%	Sigma-Aldrich	P8394
Plastic containers	Giganplast	1875/M	600 x 400 x 110 mm
Plastic trays	Piber plast	G1210A	325 x 265 x 95 mm
Polystyrene trays	Plastisavio	S24	537 x 328 x 72 mm, 24 round cells (6x4)
Copper sulfate	Sigma-Aldrich	451657
Agriperlite	Blu Agroingross sas	AGRI100
Peat	Blu Agroingross sas	TORBA250
Germination cabinet	KW	W87R
Nozzles	Teejet	XR11002-VK, TP11001-VH	The second type of nozzles are used only for glyphosate
Barcode generator	Toshiba TEC	SX4
Labels with barcode	Felga	TT20200	Stick-in labels with rounded corners
Barcode reader	Cipherlab	8300-L	Portable data terminal
Bench sprayer			Built in house
Herbicides included in the results:
Commercial product	Active ingredient	Company	Comments
Altorex	imazamox	BASF
Azimut	florasulam	Dow AgroSciences
Biopower		Bayer Crop Science	Surfact to be used with Hussar WG
Dash		BASF	Surfact to be used with Altorex
Granstar	tribenuron-methyl	Dupont
Gulliver	azimsulfuron	Dupont
Hussar WG	iodosulfuron	Bayer Crop Science
Nominee	bispyribac-Na	Bayer Crop Science
Roundup	glyphosate	Monsanto
Trend		Dupont	Surfact to be used with Granstar and Gulliver
Viper	penoxsulam	Dow AgroSciences
Weedone LV4	2,4-D	Isagro