方法细胞或DNA的精确本地化转移到着床后早期小鼠胚胎

摘要

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

摘要

操纵小鼠早期胚胎和文化是一个功能强大且主要是利用不足的技术增强这个模型系统的价值。相反地​​，细胞培养物已被广泛用于发育生物学的研究。然而，它确定在体外培养的细胞是否真正代表在体内的细胞类型是重要的。移植细胞成胚胎，随后开发期间的贡献的评估是一种有用的方法，以确定在体外培养的细胞的潜力。在这项研究中，我们描述了用于移植的细胞置于定义早期植入后的小鼠胚胎，随后离体培养的部位的方法。我们还介绍了一个使用已知直径的玻璃毛细管，允许接收与两个高转染效率和低的细胞死亡的外源DNA的细胞数的精确定位和调整优化的电穿孔法。这些技术，它不需要任何属ecialized设备，使实验操作的原肠胚形成和早期器官形成阶段的小鼠胚胎成为可能，从而在培养的细胞亚群的承诺和遗传操作原位对细胞分化的影响进行分析。

引言

细胞培养已被广泛应用在发育生物学研究中。小鼠胚胎干细胞（ESC）和外胚层干细胞（EpiSCs）可以分化成在体外所有三种胚层，并且是细胞分化早期哺乳动物胚胎发育的有用模型。这些细胞系的衍生开辟了体外操纵和本地化信号事件和转录网络在早期胚胎图案形成操作的详细调查的机会。然而，它确定在培养完成的任何操作的体内相关性仍然是重要的。对早期胚胎来源的小鼠胚胎干细胞在体内的潜力进行了评估通过引入它们放回植入前胚胎（桑椹胚或囊胚^）1。然而，这代表外胚层细胞在胚胎着床后EpiSCs不能有效地在植入前胚胎^2,3集成。我们previo我们的研究结果表明，EpiSCs可以有效地生成嵌合体，促进所有胚层，当移植到着床后的胚胎^4。因此，为了评价在体外培养的细胞的最好方法是将它们引入到它们相应的体内环境。

电穿孔是一种广泛使用的方法，提供外源分子导入靶细胞在体内和体外实验 。电能可以生成大量的细胞膜，允许外源脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA），以进入细胞孔。其中一个这种技术的最大挑战是最佳的细胞活力结合高electrotransfection效率^5,6。为在胚胎组织核酸电穿孔，镀金电极已最常被使用，允许细胞在一个宽广的空间范围^7-9定位。为了获得更多的LOCAlized基因转移，一个针状电极已被用来实现一个焦点的电场^10,11。使用这种方法，作者表明，电穿孔后，约为30-60细胞已经占用的DNA构建^11。不过，似乎能准确调节电穿孔细胞的数量保持很难与一个固定宽度电极。毛细管电穿孔技术已被用于递送质粒到单个细胞^12-14中 。然而，这种技术还没有得到应用电穿孔质粒胚胎体外。最近，一个微型装置已报道在早期着床后小鼠胚胎¹⁵局部地电穿孔几远侧内脏内胚层细胞（小于4细胞）。然而，它仍然是未知的，这设备是否能够有效地靶向外胚层和中胚层离体进行。

在这项研究中，我们描述了两种新的方法来评估在后早期细胞和基因功能-implantation胚胎。我们首先演示了如何移植体外培养的细胞变成早期小鼠胚胎中定义的网站，以评估它们在体内的潜力。在移植细胞及其后代的融合，所有标记的由例如遗传标记（绿色荧光蛋白（GFP），可以通过组织特异性蛋白的免疫染色来进一步检查^4;其次，我们描述一种改进的方法，以精确地将DNA传递在通过电穿孔胚胎定位的位点。而不是使用一个针状电极，我们插入一个细金属丝的细尖玻璃毛细管内，并表明，该变形例可以提供的DNA，以少量的细胞具有较高的效率和有限的细胞死亡。此外，我们还表明，采用玻璃毛细管不同的开口尺寸，我们可以控制电穿孔细胞的数量。因此，我们认为这种方法可以有很大的应用研究早期胚胎图案涉及少数ØF细胞。

研究方案

所有的动物实验是按照英国内政部规定如动物（科学程序）规定的法案（1986）在项目许可数量四千四百三十五分之六十〇。为了收集胚胎在特定发育阶段，定时交配共设置了O / N。中午找到一个阴道塞的一天被定胚胎一天（五）0.5。

1.剖析E7.5或E8.5着床后胚胎体外培养

1. 颈椎脱位牺牲怀孕的雌性小鼠。
2. 用剪刀，用血管钳抱着它隔离了子宫，并放置在30毫米的菜充满了M2网上平台。
3. 小心地撕开两对细镊子的子宫肌层。
4. 撕下蜕膜，小心不要刺破胚外腔。
5. 用钳子捏它，慢慢从胚胎中分离取出赖克特的膜。
6. 检查胚胎下解剖立体显微镜，以确保卵黄囊，羊膜和ectoplacental锥体完好。
7. 传输用吸管和地方胚胎M2的干净的盘子上有30毫米的塑料培养皿的盖子上冰（的'冰平台"），以部分寒意胚胎。
8. 如果需要的话，在M2的存储胚胎冰平台长达1.5小时，例如，培养基制备和操纵的小批量期间〜3-4的胚胎在RT。
   注意:恢复和啮齿类动物胚胎解剖已详细描述先前^7,8,16。

2.准备胚胎培养液

1. 新鲜解冻或者市售的大鼠血清（见格兰维尔琼斯¹³为规格等人），或大鼠血清根据考普和克罗夫特¹⁶被热灭活30分钟，在56℃和冷冻在1ml制备在内部等分试样在-80℃
   注:市售大鼠血清是可以接受的 24-36小时的培养期，虽然血清准备在公司内部，在我们的经验，卓越的文化时期长达48小时。
2. 新鲜制备的过量（例如，10ml）中定义的补充剂组成格拉斯哥最小的必需培养基（GMEM），1％非必需氨基酸（NEAA），2mM的L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠的。
3. 计算是根据该将要培养的每个阶段的胚胎数所需培养基的体积（见第3节）。混合与定义的补充剂大鼠血清，以弥补50％培养基（1:1（体积/体积）的大鼠血清:定义补充剂）和/或75％的培养基（3:1（体积/体积）的大鼠血清:定义补充剂）。
4. 通过0.45微米的过滤器通过胚胎培养基和添加万国际单位/毫升青霉素和10微克/毫升链霉素。
   注意:新鲜解冻L-谷氨酰胺和丙酮酸钠溶液是用于离体培养期间胚胎发育是至关重要的。

E"> 3。 体外培养条件不同胚胎阶段

1. 为E7.5胚胎:使用4-孔板在5％的CO ₂在37℃供给，在空气中24小时的孵化器静态培养。培养高达每孔两个胚胎在1毫升50％的培养基。
2. 为E8.5胚胎:使用一个滚子培养装置⁸旋转，在35转/分钟在37℃掺入连续放气，用5％ _的 CO 2在空气中放置24小时（1毫升50％，每个胚胎培养基）。
3. 为E9.5胚胎:使用一个滚子培养装置旋转35转速，用5％ _的 CO _2，40％O 2的55％ _的 N 2在37℃/ min供给掺入气体24小时（每毫升75％培养基胚胎）。
   注:安乐死的小鼠长时间的在M2发展产生不利影响后的3小时培养的胚胎。见考普和克罗夫特¹⁶ 体外胚胎培养的方法。

4. Graftin摹培养细胞到E7.5或E8.5小鼠胚胎

1. 物理上刮去使用20-200微升枪头EpiSCs，其中遍在表达GFP，从6孔培养板，并放置在含有胚胎30mm的培养皿
   注意:要插入的胚胎细胞团，细胞应该物理报废而不是胰酶消化。
2. 附加用手拉住嫁接毛细管的吸引管，使口吸管。
3. 轻轻吸口移液管吸取大小的一种或多种细胞团块> 20个细胞到接枝毛细管。
4. 轻轻地吹出来的细胞，以部分分散成大的团块。
5. 选择含有一个细胞丛〜:10-20细胞并再次吸入接枝毛细管，保持它靠近毛细管的开口。要小心，不要将电池丛进出毛细血管反复，避免分裂成更小的碎片。
6. 松散举行的地方胚胎一双镊子和插入术毛细管到感兴趣区域来创建的开口。
7. 轻轻驱逐丛出接枝毛细管，留下:10-20细胞遁胚胎的短字符串。
8. 重复该接枝步骤胚胎的期望数量。使用3-4个胚胎批量方便。
9. 留在M2培养基，图像使用解剖显微镜用相机荧光化合物接枝胚胎的相同盘的胚胎，保持成像时间为最小，以避免胚胎过度光和热曝光。
   注意:确定成像时间凭经验因为这些将取决于相机和显微镜，以及荧光团的性质和荧光强度的规格。
10. 与M2培养基的最小体积转移胚胎​​在pastette到预平衡的培养基（见第3节）成像后立即使用。
    注:仔细检查胚胎的形态嫁接后。只有文化的INTAC牛逼的胚胎。

5.手工电穿孔材料和设备安装（需准备以下的电穿孔实验进阶）:

1. 对于DNA注射移液器:使用水平微量拉马拉DNA注射移液器。注射移液管应具有精尖带有开口小于10μm，以避免DNA注射入胚胎空腔时的组织损伤。
2. 对于玻璃毛细管电穿孔:使用抛光仪切断DNA注射移液器到20或30微米的内径的开口。为了避免细胞损伤时，毛细管与所述胚胎电穿孔接触时，玻璃毛细管的尖端必须切割干净和不包含锐利，断裂的边缘。
3. 对于手工毛细管电极（正极）（ 图1）:插入直径为0.2mm的铂丝成电的玻璃毛细管20或30微米直径的固定开度集中选民RIC电流和递送质粒DNA到的在胚胎的兴趣的一个小区域。
4. 对于手工L形电极（阴极）（图1）:一个弯曲0.2毫米直径的铂丝创建"L"形，具有的"L"的约1毫米长的水平部分。
5. 将每个铂电极，以薄绝缘线，并将其插入覆盖绝缘胶带显微注射针持有人。
6. 安装在标准的显微操作仪​​持有人的持针器。
7. 连接电路，如图1:毛细管电极连接到电源的阳极;连接L形电极到万用表的阳极;所述mulimeter的阴极连接到电源的阴极。

6，电穿孔E7.5或E8.5小鼠胚胎

1. 用PBS电玻璃毛细管填充到1-2毫米的顶部，并插入TG1的向右铂电极（阳极）放入玻璃毛细管，直到它到达毛细管的底部。
2. 锚30毫米培养皿中填充有PBS的表面上的L形的电极（阴极）。
3. 从转移M2培养胚胎成PBS充满电的菜。
4. 插入注射针从横向外胚层到羊水胚胎的空腔。使用气动微微泵，注入DNA溶液（pCAG-Cre重组:GFP或pCAG-GFP 1-1.5微克/毫升与0.01％的绿色食用色素染料）到空腔直到完全充满。为E7.5-E8.5胚胎，小于5微升DNA溶液需要一个胚胎。使用绿色染料作为指标，注意不要爆胚胎。
5. 小心地定位在电极之间的胚胎和毛细电极移动到精确的位置，其中所述DNA是待递送。
   注意:胚胎的取向取决于在其中的DNA是被电穿孔的区域。
6. Electropo评价使用200伏（V）的胚胎在6个脉冲，每个50毫秒持续时间与每个脉冲之间一个1秒的时间间隔。
7. 转移胚胎电穿孔后，立即预平衡的培养基。如果需要，重复该过程的下一个胚胎。
   注:加入培养基放入无菌容器中，并把它放在培养孵化器预先平衡的媒介。
8. 为了检测电穿孔的细胞2小时培养后，将胚转移至用pastette M2培养基的一个干净的30个毫米的培养皿。图片使用解剖显微镜荧光化合物的胚胎如步骤5.9。
9. 成像后立即用pastette胚胎转移回文化。
10. 为了检测所造成的电死细胞，染色的胚胎用远红细胞膜​​不透核染料（1:200在胚胎培养培养基）在37℃进行10分钟2小时后电穿孔（可选）
11. 要计算的电穿孔细胞，修复安莉芳操作系统在4％低聚甲醛（PFA）为2-4小时，在4℃下，染色用紫外线或远红荧光核染液和图像使用共聚焦显微镜（可选）胚胎的核。
    注:胚胎生长，如果不太久的PBS不利影响。因此，要确保电穿孔每个胚所花费的时间最小化（<5％的胚胎分钟）。

结果

嫁接

EpiSCs该无所不在表达EGFP（R04-GFP，从E6.5外胚层衍生，和C2，从mESCs衍生体外^）4是手动从培养皿刮出并移植到不同的网站E7.5胚胎（图2A）。将胚胎体外培养和24小时后进行分析。供体细胞的分布通过荧光显微镜进行评估。如果供体细胞掺入，它们增殖和主机胚胎（图2B）内其衍生物分散。它已经观察到含有在宿主胚（图2A， 和图2B）有效地结合10月16日的细胞移植物，但是，接枝更多的细胞不会导致更好chimaerism。相反，移植细胞产生的未掺入的团块（图2C和2D）。

电穿孔

要在ssess我们的电系统的效率，我们提供绿色荧光蛋白表达质粒（pCAG-GFP和pCAG-Cre重组:GFP）在胚胎特定的网站。符合先前的研究^图11，在胚胎中检测到GFP ^+细胞后电穿孔（ 图2E与2G）1-2小时。当远端外胚层细胞在原始社会后期连胜阶段的胚胎进行电，标记细胞24小时培养（图2E和2F）后促成了神经外胚层。这一结果对应很好地外胚层细胞在原肠胚期胚胎¹⁷知天命的地图。类似地，当GFP表达质粒在E8.5（2-5个体节）电穿孔在原条^，GFP +细胞促进了近轴中胚层（图2G和2H），与已故原条^18的公知的命运地图一致。此外，我们观察到的贡献从电穿孔的细胞的所有三种胚层（图2I-K）这表明电穿孔过程不会损害体内细胞的行为。然而，我们也注意到，虽然外胚层（E7.5）或原条细胞（E8.5）进行了针对性，某些内胚层细胞还电穿孔（图3C和表1）。

一种利用毛细管电极的主要优点是，电穿孔的细胞的数量可以被控制，简单地通过改变其开口的直径。为了确定电穿孔的细胞的数量，胚胎固定电穿孔后2小时，在成像wholemount上的共焦显微镜。 ^GFP +细胞的数量是手动计算在共焦的z栈。表1表明，对于一个给定的阶段中，由多个小区增加从20至30微米的结果中的DNA摄取的玻璃毛细管的开口尺寸。当单个开口大小级之间比较（E7.5与E8.5），发现更多的细胞在后期被电。这种效果可能是由于存在于羊膜腔在E8.5的DNA的浓度较高。因为DNA溶液与绿色食用色素混合，我们可以使用绿色，以评估在羊膜腔DNA浓度。在显微镜下，很明显的是，当与E8.5胚相比，DNA注射后的绿色的颜色是在E7.5胚胎的空腔轻得多。虽然DNA溶液相同浓度注入E7.5和E8.5的胚胎，多个DNA溶液在E8.5胚胎为了羊膜腔以完全填充它，因为它们在大小。抽出注射针后，总有一定程度的从羊膜腔DNA溶液的泄漏，并且由于穿孔是在比较早期胚胎羊膜腔的大小大，则很可能是有比例更泄漏从E7.5 E8.5比胚胎，从而导致较低的DNA浓度。的不同数量的染细胞还可能是由于在不同阶段的不同直径的细胞或诱导的跨膜电压（ITV）阈值。

电穿孔的一个缺点是相关联的细胞死亡。类似于传统的镀金或针状电极，使用毛细管电极电穿孔也导致细胞死亡。电穿孔后的目标区域中的颜色出现较暗相比邻近区域（图3A和3B），表明某种程度的细胞死亡的必须发生在这一区域中。为了进一步确定所造成的电穿孔程序死细胞的数量，胚胎染色用荧光细胞膜不透核染料。死细胞的细胞核进行标记，用膜不透远红光荧光染料。染色确认这毛细管电穿孔技术只导致小的数目邻近电穿孔部位死细胞（图3D和Ta的BLE 1）。

我们注意到，虽然死细胞出现在电现场^，GFP +细胞和死细胞也最独特的彼此（图3E和3F）。此外，当在E8.5尾侧外胚层电穿孔用pCAG-GFP和20微米的玻璃毛细管开口，大量的GFP ^+细胞的48小时培养中（图3G和3H）后进行检测。两者合计，这些结果表明大多数^的 GFP +细胞中检测到2小时电穿孔后仍存活在进一步培养。

我们后24小时体外培养打进^的 GFP +细胞的数量。六个胚胎电穿孔pCAG-GFP在E7.5，使用20微米直径的毛细管开口。 107±31（平均值±标准差） ^的 GFP +细胞/胚胎进行检测。因为在培养物（2小时）的开始，9细胞进行电穿孔，平均每个胚胎（ 仲>表1），这表明，电穿孔的细胞进行3-4司内2小时。平均气泡从E7.5倍增时间至E8.5胚胎是6-7小时内所有细胞除了那些在腹侧节点^19,20。这表明，电穿孔过程不妨碍正常的细胞生长。

图1.电路图表示电穿孔设置。在其羊膜腔含胚胎DNA溶液置于两个电极之间。电流在所选定的参数是由方波脉冲发生器（电源）提供的。万用表串联连接，检测电流通过胚胎。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2.接枝或电穿孔的细胞在宿主胚胎的分布。（AH）GFP荧光重叠（绿色）上wholemount胚胎（灰度）（A）的明视野图像10月16日^的 GFP + EpiSCs移植到较晚的远端区域-streak阶段的胚胎。（℃） ^的 GFP + EpiSCs的较大丛被嫁接到中间条纹阶段的胚胎的远端区域。（B和D）在宿主胚胎EpiSCs衍生的细胞（绿色）的分布（在所示A和C）24小时培养后，分散在宿主胚（B）中 ^的 GFP +细胞，提示供体细胞的正确整合。（D）的接枝较大的细胞团块导致非法人丛形成的宿主胚。 （EK）pCAG-Cre重组:GFP质粒ELE ctroporated成野生型胚胎的特定区域。电穿孔的早期芽阶段胚胎（E）或一个2-5体节阶段胚胎（G）中的原条的远端区域造成的GFP ^+细胞在这些区域中2小时后的程序。 （F和H）的GFP ^+细胞在宿主中的胚胎24小时培养后的分布，显示出电穿孔细胞向神经外胚层（黑色箭头）（F）和近轴中胚层（白色箭头）（H）（IK） DAB免疫染色将GFP ^+细胞显示出电穿孔的细胞可产生神经外胚层（I）中，中胚层（J）和内胚层（J和K）24小时培养后。比例尺（AH）= 250微米;比例尺（IK）= 100微米。注意:图1A和1B是从我们的先前出版物⁴重印。HREF ="htt​​ps://www.jove.com/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

图3.分销^GFP + 细胞和死细胞的电穿孔后的胚胎 （AC）pCAG-Cre重组酶:GFP质粒电穿孔到E8.5的尾部横向外胚层细胞（2-5体节期）胚胎（毛细管开孔尺寸:20微米）（A）的 2小时后的程序，该目标区域呈暗颜色（白色箭头）相比，胚胎的其他部分。插图示出电穿孔区域的放大图。（B）的明场图像（灰度）覆盖有绿色荧光通道表示电穿孔的细胞（绿色）。（C）的共焦的z切片显示出2内胚层细胞（绿色）也采取了质粒时，尾部的横向外胚层细胞进行有针对性的。细胞核示于红色（DF）pCAG-Cre重组:GFP的质粒电穿孔在E8.5胚胎的节点的尾部方面（毛细管开口尺寸:30微米）。胚胎中培养2小时。电穿孔的细胞中显示绿色和死细胞为红色。（D）中的电穿孔的区域包含^的 GFP +细胞以及死细胞。在白盒的区域中一个共焦显微镜进一步分析。的z叠层的人工计数表明，有33的GFP ^+细胞和 23的死细胞在这个区域。只有两个细胞均为阳性两个荧光团。（E和F）共焦的z切片从白盒装区域D中的XYZ视图，示出^的 GFP +细胞是分离的死细胞。细胞核以蓝色显示（G和H）pCAG-Cre重组:GFP的质粒电穿孔到几大公在E8.5胚胎的尾侧外胚层的ls（毛细管开口尺寸:20微米）和成像后两（G）和 48（H）的小时体外培养注:（H）的胚胎进行培养后切断为两半。除去头部和心脏地区。比例尺（A，B，D，G和H）= 250微米;比例尺（C，E和F）= 100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

开口毛细管的直径	胚胎阶段	电穿孔效率:没有。胚胎含有绿色荧光蛋白+细胞 2H /总无后。中电穿孔胚胎（无。GFP +胚胎在24或48小时培养后发育正常）	GFP平均数+细胞 ，每个胚胎±标准差（n = NO。检验胚胎）	数按每个胚胎GFP +内胚层细胞±标准差（n = NO。检验胚胎）
20微米	E7.5（LS-LB）	7/9（7）	9±3（n = 4时）	4±2（n = 4时）
为30μm	E7.5（LS-LB）	十五分之十三（12）	17±2（n = 4时）	6±1（n = 4时）
20微米	E8.5（2-5体节）	12个/ 13（10）	21±4（n = 4时）	11±4（n = 4时）
为30μm	E8.5（2-5体节）	2/2（2）	33和26（N = 2）	14和16（N = 2）

pCAG-Cre重组酶的表1电穿孔效率:在小鼠胚胎GFP质粒。
缩写:LS，已故原条的阶段; LB:后期萌芽阶段。胚根据上演Downs和戴维斯¹²

讨论

嫁接

用于细胞移植实验的关键步骤是细胞的相干串的插入理想地在一个单一的动作，避免了丛的解体。这种技术需要在控制口吸管一些练习。如果供体细胞掺入以及在宿主，其衍生物将分散在胚胎。为了进一步确定分散供体衍生的细胞是否分化适当的宿主，免疫染色可以在胚胎切片来执行。如果供体细胞是不与主机环境相兼容，它们或者不能被检测（因为它们是从胚胎排出）或形成培养后的胚胎未掺入团块。如果这两个分散的细胞和细胞块进行了观察，这可能表明过多的细胞移植和过度供体细胞不能与周围的宿主细胞相互作用导致丛形成。在这种情况下，包含其他移植物可以进行细胞的数量较少。

细胞移植技术的主要限制是它不可能确定随时间超过48小时一直没有实现，因为鼠离体培养的细胞的全部体内潜力。然而，如果结合超声引导细胞注射，它可能会向在子宫内培养的细胞转移到胚胎。总之，细胞移植实验已经广泛应用在我们的组和给予我们关于各种细胞类型^4,21,22 的体内潜在有价值的线索。它是一种通用的技术来评估在早期胚胎着床后在体外培养的细胞的体内潜在。

电穿孔

虽然在本研究中，我们只表明，它是有效的是使用毛细管电穿孔技术目标外胚层，我吨，还可以有意地靶向其它胚层如内胚层细胞。用于毛细管电穿孔技术的关键步骤是尽量减少电穿孔每个胚（<5％的胚胎分钟）所花费的时间以来的PBS是非常不理想的早期小鼠胚胎。我们的数据上面已经表明，在大部分地区，在胚胎中，电穿孔不影响胚胎的生长。然而，电的节点造成畸形发展，导致胚胎的过早死亡。这可能是由于形成重要的信号的中心^23上的细胞的损伤或死亡。因此，这个区域就必须避免与这种技术。另一个需要注意的是，正如结果部分，而外胚层或原条细胞进行有针对性的，有内胚层细胞也被电。这可能是因为DNA通过下外胚层上皮间隙到达内胚层。内胚层是由上皮细胞，并在我们的经验日ESE细胞具有更高的倾向占用的DNA。因此，应用这种技术的命运映射时，必须评估哪些细胞最初占用的DNA是非常重要的。

还应当指出的是，虽然pCAG-GFP和pCAG-Cre重组:GFP的质粒可以有效地使用在本研究中所示的电穿孔参数递送，其他DNA构建的效率可能会发生变化，并且需要单独优化。在DNA浓度，电穿孔电压或脉冲数改变可以如果质粒被发现是困难的转染来制备。

总之，我们已优化的毛细管电系统能够高效，重复地提供绿色荧光蛋白或酶Cre:GFP质粒到极少数的细胞在有限的细胞死亡的胚胎。由于该方法不需要昂贵的或高度专业化的设备，它可以是对细胞跟踪研究或在测试中异位表达或条件缺失邻的效果大用处在早期胚胎˚F基因，如果电在胚胎携带两侧装接loxP条件突变等位基因进行。因此，该电穿孔技术为理解上的细胞通过细胞基础的细胞内在因素的作用在局部野生型胚胎的环境的上下文中有用的官能工具。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Dumostar	T5390
Dissecting stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000-C
Stereomicroscope system with fluorescence	Nikon	AZ100
Inverted microscope with a digital camera	Olympus	Olympus BX61
Inverted confocal microscope	Leica Microsystems	Leica TCS SP8
Low melting point agarose	Life Technologies	16520-050
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	11397863
30mm Petri dishes	Fisher Scientific	121V
4-well plates	Thermo scientific	179820
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Life Technologies	10010015
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148
Pipettes	NICHIRYO	Nichipet
tips	Greiner Bio One	685280
Cell culture incubator	SANYO	MCO-17AIC
Roller culture apparatus	BTC Engineering
Syringe filters 0.45µm, sterile	Sigma-Aldrich	10462100
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)	Sigma-Aldrich	G5154
non-essential amino acids (NEAA)	Life Technologies	11140050
L-glutamine	Fisher Scientific	SH30549.01
Sodium pyruvate solution	Fisher Scientific	SH30239.01
Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml	Lonza	DE17-602E
Gas Cartridge for Portable Meker Burner	COLEMAN	COLEMAN 250
Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm	Harvard Apparatus	640798
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma-Aldrich	A5177-5EA
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-97
Microforge	De Fonbrune	BS030301
Pneumatic pico pump	World Precision Instruments	PV830
Microloader tips	Eppendorf	5242956.003
ECM 830 square wave pulse generator	BTX	45-0002
Green food coloring dye	Sigma-Aldrich	C.I. 42053
A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye	Biotium	40060-T
pCAG-Cre:GFP	Addgene	#13776
pCAG-GFP	Addgene	#16664
Multimeter	Excel	XL830L
Micromanipulators	Leitz
0.2mm diameter platinum wire	Agar Scientific	E404-2
Anti-GFP antibody	Abcam	ab13970
Goat anti-Chicken IgY, HRP	Santa Cruz	sc-2428
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System	Dako	K3467
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Life Technologies	D21490
A far-red fluorescence nuclear counterstain	Life Technologies	T3605