人类前列腺上皮的激光捕获显微切割的RNA分析

摘要

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

摘要

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

引言

前列腺是一种异质性组织安排在腺体腺泡由肌纤维间质主要由平滑肌组成¹包围分泌上皮细胞组成。上皮隔室由五个不同但有组织的细胞类型:基底细胞，分泌细胞，神经内分泌细胞，短暂扩充细胞和干细胞^2。在前列腺癌（PCa），它产生于腔上皮细胞，腺癌的生长会导致基质^室 3的一个明显的渐进性下降。由于这些原因，组织标本将具有在基质和上皮细胞类型的基于前列腺癌的程度的比例有明显的差异。这些差异会导致从整个组织，不考虑所期望的细胞类型的显微解剖获得的基因表达数据的偏颇的假设。因此，为了消除这种偏差，必须事先对RNA提取和分离的细胞类型基因表达分析。

Macrodissection或显微切割可用于物理地从周围基质^{4 -6}分离充分表征的上皮区域。 Macrodissection典型的做法是与在解剖显微镜下用刀片和可以很好地用于分离大前列腺癌从基质结节，但是不能够从周围的基质中除去良性上皮的（参见实施例良性前列腺组织学于图1）。显微切割用激光（LCM）比macrodissection显著劳动密集型的，但可以非常精确地解剖良性上皮^4。

从我们的实验室最近的出版物已经表明，核糖核酸可以成功地通过从任一福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的活检或冷冻的组织^4,7-9 LCM萃取。在LCM-RNA提取的主要挑战是:1）精确解剖组织的所需区域，和2）以保持ř液晶显示模块和分离过程^4,10中NA的完整性。从纯的细胞群中分离RNA可通过多种方法，包括反转录定量PCR（RT-qPCR的^）7,8，微阵列^11，和深-sequencing ^12-14中可用于基因表达分析。

该协议的目的是从隔离LCM前列腺上皮的总RNA从冷冻的组织为下游基因表达分析。

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研究方案

通过机构审查委员会批准的协议和/或豁免在伊利诺伊大学芝加哥分校获得了用于这些实验的所有人体组织。

1.第新鲜冰冻前列腺到PEN-幻灯片，到带电玻片

1. 前一天或切片样前几个小时，清洁工具（即，刷，镊子，coplins，叶片，PEN框载玻片（如果不是已经无RNase），一个ETOH安全标记和铅笔）和一个内室温的低温恒温器，使用喷雾瓶和实验室湿巾RNase的去污溶液。
   1. 允许RNase的去污溶液坐5分钟擦去前，用depcH ₂ 0冲洗，以除去遗留RNase的去污溶液中，用70％乙醇的最终漂洗（制备有depcH ₂ 0）。
      注意:重​​要的是要保持无RNase的工作区。所有coplins，工具，冻结的安装中，叶片和使用的幻灯片，应仅用于核糖核酸酶免费工作与从未使用在标准的非无RNA酶的环境。所有仪器必须与每个实验之前核糖核酸酶去污溶液进行处理。
2. 低温恒温器冷却至-24℃。
3. 将下面的清洁无RNA酶的仪器内的低温恒温器，以至少30分钟冷却切片之前:滑动科普林填充了100％的乙醇，工具，小型冷冻组织盒和安装卡盘。
4. 检索cryostorage和地方冷冻前列腺组织成一个干冰填充泡沫桶运输。放置入组织冷冻切片机平衡到低温恒温器温度为至少30分钟。
   注意:人类前列腺组织的激光捕获显微解剖可以是新鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）。时间紧迫和幻灯片准备是组织源之间略有不同。在这里，我们描述的步骤进行冰冻切片。
5. 有一个组织在工作时间和喷射冰冻安装介质插入戈巴托使用冷冻镊子盒的米，并迅速装入冷冻的前列腺组织进入冰冻封固剂。
6. 放置与组织盒到冷却器中的低温恒温器5分钟以设定冷冻封固剂。
7. 喷射少量冰冻安装介质上的吸盘和高达小心地按上的组织下侧到冰冻的安装介质。让在低温恒温器设定为5分钟，以允许冷冻封固剂完全固化。
8. 将卡盘插入支架，并拧紧。
9. 锁定手柄锁定位置，并把新刀片到低温恒温器。为下游分子端点包括扩增步骤（即，定量PCR），建议使用一个新的刀片针对每个病人，以防止污染（或移 ​​动刀片转移到为下一个样品使用叶片的面积）。
10. 解锁手柄，通过用手或用脚踏小心推动组织到连和暴露组织用50μ米的部分，直到所需的组织暴露为止。
11. 调节低温恒温器至5μm，切一个或两个部分，并将其放置到充电载玻片用于苏木精和伊红（H＆E）染色（参见步骤2）。
12. 立即滑动放入冷100％乙醇2分钟。
13. 从乙醇中除去带电的载玻片上并让它干燥在RT前进到H＆E染色（步骤2）之前。
14. 将RT PEN帧幻灯片的帧支持。
15. 低温恒温器调整到10微米和地点节到RT PEN帧幻灯片。一到四个部分可以放置到根据组织规模每张幻灯片。
16. 立即沉浸滑动进入冷100％乙醇2分钟。
17. 从乙醇中取出笔帧幻灯片，并在幻灯片中的幻灯片存储在干燥器中在-80℃冷冻，直到准备LCM。三天的最大存储时间为最佳RNA回收。
18. 继续执行步骤2只收取玻璃滑即继续执行步骤3笔帧幻灯片。

2. HE染色-Y（H＆E）染色的组织学标记机

注:本如果在充电载玻片上组织不是LCM笔帧幻灯片。

1. 通过梯度乙醇水合物浸渍幻灯片上带电载玻片的部分如下:在70％乙醇浸滑动在100％乙醇两次持续3分钟，在95％乙醇两次持续3分钟，一次3分钟和两个在蒸馏_的 H 2 O时间3分钟。
   1. 制备酸醇溶液99毫升70％乙醇+ 1 ml的1％HCl和0.1％碳酸氢钠溶液:0.1克碳酸氢钠在100毫升蒸馏水_H 2 O的
2. 浸在苏木吉尔II（0.4％），滑动5分钟。
3. 在稳定运行阶H _{2 O} 3分钟洗掉多余的污点。
4. 浸滑酸醇10倍
5. 在自来水_H 2 O的3分钟清洗的幻灯片。
6. 浸滑在0.1％的碳酸氢钠溶液30-60秒转动紫色颜色为蓝色。
7. 在自来水_H 2 O的3分钟清洗的幻灯片。
8. 漂洗在95％乙醇的滑动用10骤降。
9. 浸滑的曙红-Y 2-3次，持续15秒的总。
10. 通过梯度乙醇脱水幻灯片如下:沾下滑95％乙醇的两倍，在100％的乙醇两次，两次二甲苯（确保它表示彻底脱水的组织出现明显的）。
11. 安装有非水永久硬封固剂和盖玻片的幻灯片。
12. 让滑动干燥30分钟。
13. 扫描幻灯片与任何整个幻灯片扫描仪和打印大型，高分辨率图像到8"×11"的纸张。
14. 感兴趣的领域纲要用记号笔（通常由一个委员会认证的病理学家完成）。此标记是LCM的程序指南。

笔帧幻灯片3.甲苯胺蓝染色

注:钍在完成当天的LCM。使用depcH _{2 O}水中所有的解决方案。完成在无RNase区域的所有步骤。所有coplins必须用RNase-去污溶液进行清洗。

1. LCM的天除去从-80℃冷冻室和水合物的PEN-帧滑动通过缓倾滑入90％乙醇2分钟，然后75％乙醇2分钟。
   1. 制备0.5％甲苯胺蓝溶于在分子生物学级水，然后过滤灭菌，通过0.2微米的过滤器，并储存在室温。此溶液可以被重新使用长达6个月。注:强烈建议准备的溶液，作为过滤可以采取几个小时之前。
2. 由缓倾滑入0.5％甲苯胺蓝5-30秒的染色前列腺组织。脱色通过洗涤所述组织滑动的2倍depcH _{2 O，}持续15秒，随后通过75％乙醇30秒至3分钟。注意:染色和脱色时间可以调整，以保证良好的染色。前列腺往往超过污点。
传送PEN帧幻灯片RNA酶，无干货集装箱冰上。

4.激光捕获显微解剖（LCM）

1. 紧接的LCM，在幻灯片在42℃温暖15分钟干滑动。干只将被处理，并在冰上其余存储直到准备为他们的幻灯片。
2. 打开LCM和计算机的顺序，显微镜功率，激光键，激光开关，然后计算机。启动激光显微切割软件。
3. 使用该软件，以控制显微镜加载幻灯片和收集管。点击"卸载样品架"，加载使用部分滑动到显微镜幻灯片持有人与组织朝下并插入在显微镜下的相应插槽幻灯片固定器，然后单击"继续"。
   1. 点击"卸载收集管"，标签和负载0.5 mL管到管座和在仪表相应的插槽中插入。一旦瓶盖固定，加入35微升裂解液的收集瓶盖，尽量避免气泡。然后单击"确定"。
      注意:如果蒸发是一个问题，稀释缓冲如下:将25μl的裂解缓冲液与10微升depcH2O。
4. 在软件中，选择幻灯片已经被放置在载片支架的位置。选择收集罩收集LCM标本。
5. 可视化和注重通过电脑幻灯片在10X。使用该软件通过选择"激光"，然后"校准"来校准激光。调整激光的功率，光圈和速度，选择"激光"，然后"控制"，以允许所述激光束切割完全和有效地选择的区域。重复调整，直到激光切割完全穿过组织。
6. 使用8"×11"病理学家加价为指导，用"画形"的工具，外接上皮的所需区域lium在视图中，并避免收集任何基质。
   注:多个区域可以在一个视图中选择，但是不要点击"切形"工具移动到另一种观点认为不先切割。
   1. 如果一个地区没有得到完全由激光切割使用"移动和切"工具手动过目一下。继续移动物镜，以新的观点，并重复激光切割，直到滑动被完全切开或已采集的组织的所需量（通常为100良性腺体收率150-500纳克的RNA）。 （参见例如在图1A）。
7. 小心地从收集架管和关闭帽，被铭记在帽裂解液和组织。短暂离心30秒，收集的液体和组织在管的底部。孵育样品在42℃进行30分钟，并储存于-80℃，直到准备用于RNA分离。

5.总RNA分离与费尔之三为基础的工具包和质量分析

1. 解冻管在冰上，使溶液的体积为100微升。
2. 通过施加30微升ofLysis解滤波器的中心预润湿的RNA分离试剂盒的微过滤器，并允许它浸泡whileperforming下两步（至少5分钟）。
3. 加入3微升LCM添加剂溶液（试剂盒中提供），以裂解物并通过涡旋混合5秒。离心30秒在试管底部收集流体。
4. 离心预湿的过滤器〜30秒，最高时速去除液体。
5. 添加1.25体积的100％乙醇（在这种情况下，129微升）以裂解物混合物中，轻轻涡旋或吸管上下。 **此方法将恢复大和小RNA种类。
6. 加载样品到预润湿的微过滤器，和离心机在10,000rpm×g离心1分钟，以结合核糖核酸到过滤器。然后洗微过滤器180微升"洗涤液1，R21;离心在10,000rpm×g离心1分钟。
   注:从这点上的所有离心应该13,000 XG，或最高速度来完成。
7. 洗涤用180微升"洗涤溶液2和3"，分别过滤两次的指示该试剂盒的协议。离心30秒，然后丢弃通过流，和自旋过滤器，持续1分钟，以除去残留的流体和以干燥过滤器。
8. 转移过滤到一个新的收集管。
9. 暖洗脱溶液至-95℃（由试剂盒提供）。
10. 申请10微升预热洗脱溶液在过滤器的中心，盖上并存储5分钟，室温。然后离心1分钟以洗脱RNA，并重复此步骤一次，得到〜20微升的RNA。
11. 进行DNA酶I处理15分钟，在37℃。
12. 量化的RNA通过分光光度计260nm处的吸光度。光密度在260毫微米和280毫微米波长的比率被用来评估的纯度的核糖核酸（ 见表 ^1）15。

6.基因表达分析

注意:长RNA种类（像的mRNA和lncRNAs）的基因表达被示出在步骤6.1和短RNA物质（如微RNA）示于步骤6.2。不同套件可用于RT-qPCR的和由试剂盒所需RNA的量而变化（如少至10毫微克）。 RNA测序分析在6.3节。

1. 逆转录（RT）的RNA成cDNA混合5微升20毫微克/μLRNA样品与5微升RT主混合物（RT缓冲液，的dNTP的，随机引物，逆转录酶，RNA酶抑制剂）。孵育25分钟，反应在25℃，然后120分钟，在37℃，5分钟，在85℃。
2. 稀释RT反应1:10无RNA酶的水，并使用每10微升的qPCR反应2.5微升用引物或引物/探针组的目的基因。
   注:为方便部分降解RNA分析最好是使用底漆FOř短扩增子（小于^{100bp）16（}表2B）
   1. 对于微小RNA表达分析运行混合5微升2-10纳克/微升RNA样品与5微升RT主结构的RT反应。
      注意:每个市售基于PCR微小RNA检测技术需要使用的专有和特异性RT引物。
3. 可替代地或除了RT-PCR，使用下一代测序（RNA测序或小核糖核酸-SEQ）来量化不同物种的RNA。通常情况下，使用500ng的RNA用于此过程（见表3）和实施该方法由生产和检测仪所指示的。

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结果

在先前的研究中，我们展示了采用LCM来收集上皮细胞和间质组织由基因和微RNA的RT-qPCR的冷冻和FFPE前列腺组织来自同一患者⁴比较表达谱。 LCM非常耗时，尤其是当大量的RNA被收集新一代测序分析。因此，关键的是要保留的工作空间和工具无RNA酶。建议检查收集（更详细地在下面的段落中讨论）的RNA的质量和细胞特异性的控制。 图1显示之前和之后激光俘获良性上皮在显微镜下PEN...

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讨论

基因表达的来自人的标本分析可以是具有挑战性的，不仅对质量或组织的可用量，同时也为存在于一个给定的组织标本的各种组织学实体。这是在其中良性组织基本上是间质组织和癌症领域是不含基质的前列腺特别具有挑战性。 LCM促进前列腺间质和上皮的RNA物理分离为两种不同的细胞类型（图1A）的更精确的签名。在比较macrodissection或全部组织处理，LCM可以分离细胞区室中良性组织?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNase-AWAY	MBP	7005-11
PEN-membrane 4.0 mm slides	Leica	11600289
Glass slides, Superfrost Plus	FisherBrand	12-550-15
Ethanol 200 proof	Decon labs.	2701
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D-5758
Cryostat	Leica	CM3050
Coplins (Staining jar)	IHCWORLD	M900-12
Coplins (Staining rack)	IHCWORLD	M905-12
Aperio ScanScope	Aperio(Leica)	ScanScope® CS
Toluidine Blue	Fluka	89640-5G
Laser Microdissection System	Leica	LMD7000
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM	Thermo Scientific	AB-0350
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit	Ambion	AM1931	Thermo Fisher Scientific Brand
NanoDrop	Thermo Scientific	ND-1000
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32866	Thermo Fisher Scientific Brand
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystems	4368814	Thermo Fisher Scientific Brand
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301
TaqMan microRNA RT kit	Applied Biosystems	4366597	Thermo Fisher Scientific Brand
Hematoxylin stain	Ricca Chemical Company	3536-16
Eosin-Y	Richard Allan Scientific	7111