对水样的自动固相萃取小污染物的免疫学分析的简单方法

摘要

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

摘要

对环境水样的固相萃取（SPE）的新方法。所开发的原型是成本效益和用户友好的，并能进行快速，自动化和简单的SPE。预浓缩的溶液与通过免疫测定分析兼容，具有低的有机溶剂含量。一种方法被描述为天然激素17β雌二醇在100ml水样提取和预浓缩。反相SPE执行与十八烷基二氧化硅吸附剂和洗脱用200μl甲醇50％体积/体积的完成。洗脱剂是通过将二 - 水，以降低甲醇的量稀释。手动制备SPE柱后，整体过程1小时内自动执行。在该过程结束时，雌二醇浓度通过使用市售酶联免疫吸附测定（ELISA）进行测定。 100倍预浓缩得以实现，在只有10％体积/体积的甲醇含量。完全恢复的分子用1ng得以实现/升掺入去离子和合成海水样品。

引言

样品制备是在任何分析过程中的重要一步。特别是，除去基体效应，干扰的缩减，且分析物的富集是必要的，以获得精确的结果，并达到检测的低限。内分泌干​​扰化合物（内分泌干扰物）是特别值得关注的，因为它们对活的生物体的动作，即使在环境中存在的非常低的水平。天然激素17β雌二醇存在于欧盟水污染的收藏和容易被加入到根据欧洲水框架指令调节优先物质清单。固相萃取（SPE）通常适用于小的污染物在水中的分析，与两个化学^1-5（色谱，质谱）和免疫^6-9检测方法。后者积累了环境监测领域的兴趣，如免疫测定法是在大量的各种格式提供，特定于たrget分析物，和达到低检测极限^{。6，7，10，11}的各种酶联免疫吸附测定（ELISA）是可商购，并使得能够分析多个样品同时上的多孔板。该过程包括在连续的反应步骤，可能需要几个小时。反应的最终产物，可以检测光学来确定基于校准曲线对目标分子的浓度。

经典的SPE程序包括吸附剂预调节，样品萃取，清洗，洗脱，浓缩由洗脱液蒸发。用于稀释该提取物的溶剂选自根据检测方法。对于免疫学方法中，有机溶剂的影响强烈的方法的灵敏度的量^。12

除了回收和预浓缩的表演中，该方法也需要简单和成本效益。在再修改的自动化Ë有助于减少人类相关的错误。在我们以前的工作¹³我们推出了样机的自动固相萃取，而我们的方法适用于天然激素17β雌二醇海水样品中的分析。在本视频中，我们想强调我们方法的技术优势相对于传统的离线和在线SPE，以及它与通过检测免疫反应的具体的兼容性。我们描述适用于水样品17β雌二醇的检测的协议。 SPE与十八烷基硅胶（C18）吸附剂相和洗脱用稀甲醇进行执行。

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研究方案

注意:下面的协议说明了SPE 100毫升的水样品与C18的吸附剂和洗脱用50％体积/体积甲醇进行。富集的样品稀释分析用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒的酶之前达到10％体积/体积甲醇。

1.准备试剂

1. 制备水样
   1. 之前的任何其它步骤，筛选各100毫升的水样品与0.2μm孔径的过滤器。
   2. 通过稀释的参考溶液适当体积入水体积穗与期望浓度的样品。例如，制备100毫升的水样品与E2的100纳克/升的稀释3.3微升的E2参考溶液在300微克/升的浓度。稀释此溶液十次以获得一个样品掺入10纳克/升的E2。稀释后者另一个十倍，得到100ml的样品与1纳克/升的E2。
   3. 放置过滤后的样品（未修饰的或加标）在玻璃瓶中以GL45线程。使用示例在同一天。取一小部分，以与ELISA法进行分析，来估计初始浓度。
2. 通过在去离子（二 - ）水在紧管稀释甲醇至50％体积/体积制备300μl的洗脱液。

2.制备固相萃取柱的

1. 通过加入第一1600微升甲醇中，然后加入400μl的二 - 水至40mg反相吸附剂的制备20毫克/毫升悬浮十八烷基二氧化硅吸附剂颗粒。盖紧盖子，搅拌用旋涡。
2. 安装在塔底部的膜
   1. 选择一个尼龙膜孔径为11微米，将其放置在防尘组织构成的双层。用3毫米直径冲头，切断在膜2的小零件。
   2. 抓住小膜用平头镊子过滤器之一，并将其​​放置在列的一侧。
   3. 拧平底接头与管并拧紧。该膜为n流到位和吸着能够可靠地加入。上朝向的最后一列指示的体绘制的箭头，其中膜置于。
3. 准备填充吸附柱
   1. 固定柱向底部的箭头指向在支架上。列必须是垂直地设置。
   2. 附加空10毫升一次性注射器到列的管的端部，通过使用鲁尔锁定连接​​器。
   3. 准备微量移液器用20-200微升小费，定容至100微升。此枪头格式适于吸附剂柱的要制备的大小。该程序将具有较大的枪头，如用1毫升吸管中使用的那些更加困难。
   4. 搅动吸附剂悬浮液用涡旋，并迅速吸管100微升在中心上的列。同时注入，吸轻轻所有移液溶液通过使用注射器用另一只手槽膜。在这届年龄，溶液灌装注射器必须明确微粒，粒子床最终可以在列中观察到。
   5. 通过搅拌所有移液步骤之间的纸浆悬浮液，以确保在溶液中的颗粒的均匀悬浮液重复此过程2次。由此产生的列包含吸附剂6毫克。
   6. 当将300μl悬浮液已被加载并通过用注射器抽吸干燥，保持注射器在适当位置，并放置在顶部的第二尼龙膜通过使用钳子用另一只手。
   7. 拧紧第二个连接器管和处置注射器。该固相萃取柱就可以使用了。

3.准备系统

1. 通过使用鲁尔锁接头拧紧设备上的固相萃取柱。箭头必须是指向相同的方向在设备上显示的。
2. 通过拧紧连接含有样品到装置中的瓶它提供了GL45安全帽。
3. 加载200微升洗脱液中的"淋洗液"水库。
4. 负载800微升二水的"稀释"水库。
5. 将一个瓶在排污口在提取步骤收集处理过的水。格式并不重要，但体积需要足够大的方面的样品体积。
6. 将小瓶在1.5毫升体积最小容量的传感器出口。 1 mL的最大容积将过小，收集丰富洗脱液和稀释液时气泡会形成在该出口。
7. 验证压力调节器处于关闭位置时通过手动转动它，反向旋转，直至进一步的移动是不可能的。

4. SPE与原型

1. 通过按下背面的按钮开关上的原型。
2. 制备用户界面和选择程序
   1. 打开用户界面。选择计算机的通讯端口来进行设备从列表连接，然后点击按钮"下一步"。
   2. 输入值580 PSET和30 dpset。泵将调整运行时，以维持在加压系统和储层压力，在580±30毫巴。
   3. 选择自动模式。
   4. 在自动模式下的角落，装入箱子"配置文件路径"程序文件。
3. 调节压力调节器
   1. 启动泵。
   2. 手动转动压力调节器，直到读取预浸料值小于但接近320毫巴。
   3. 停止泵。
4. 启动SPE程序
   1. 按在自动模式下的角落"开始"。泵将接通和提取，洗脱和稀释步骤将自动跟随另一个。在50分钟中进行，整个过程在100毫升样品。
   2. 验证预浸的值。它必须是在范围320 - 350毫巴在提取步骤以确保最佳的流速。
   3. 关闭小瓶并储存在4-5°C黑暗直至分析。在下面的30小时进行分析，以防止分析物的降解。
   4. 处置处理过的水。
5. 清洁系统
   注意:在待清洁每次萃取步骤的系统需要防止交叉污染。
   1. 制备甲醇70％体积/体积的在一个GL 45玻璃瓶10ml的溶液中。
   2. 拔下固相萃取柱和插头与连接器的管道。
   3. 在自动模式下，选择"清洗"文件和相同的压力设置启动。

5.检测与ELISA雌二醇浓度

1. 制备校准样品浓度在设有所使用的ELISA试剂盒的协议表示。准备一张CALIBRA中置具有相同的矩阵作为样品，和一个校准设置用甲醇10％体积/体积。
2. 分配在盘上的孔中的样品的所需量，根据制造商的说明。使用校准样品，过滤但未处理与SPE，和丰富的样品甲醇10％V不变并加标水样/ V。使用每样本3个孔，以减少与测定相关的误差。
3. 遵循即随试剂盒提供的反应物的加入，培养时间，洗涤和进一步反应与酶的协议的指示。
4. 读出的光信号在每个孔中根据试剂盒制造商的用酶标仪仪器指令和收集数据。
5. 使用平板读取器仪器的软件，以适合校准曲线，并确定与相同矩阵的初始样品中的E2浓度，并且在富集样品用甲醇10％体积/体积。

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结果

吸附剂填料的再现性通过干燥评价和加权在玻璃小瓶的移液吸附剂，结果示于图1。重复性的喷射时100ml中的样品进行了测试，如在初始和预如图 2所示。浓度浓缩加标样品通过使用商业ELISA试剂盒17β雌二醇测定，并示于图3。

所提出的方法包括在制备吸附剂相（

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讨论

提出了水样然后分析使用免疫的制备新方法。该仪器能够以自动化和用户友好的方式进行固相萃取。

水样其注射之前到系统的过滤是非常关键的。溶液中存在的任何微粒仍然会潜在地引起流体网络的堵塞和阻碍SPE柱。另一个重要步骤是在SPE柱的制备。在列颗粒的量是至关重要的，以达到最佳的性能成为可能。制备吸附剂颗粒的悬浮液时，避免了粒子的附聚特必须小心​​。?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filter membrane 0.2 μm pore size	Merck Millipore	GNWP04700	For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore size	Merck Millipore	NY1104700	For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mm	Medical Budget	39302439
Nucleodur C18 ec	Macherey Nagel	713550.01	50 μm particle diameter
Synthetic sea water	Sigma Aldrich	SSWS500-500ML
Methanol	VWR
17beta-estradiol standard	Enzo Life Science		300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kit	Enzo Life Science	ADI-900-008	96 wells, range 30 - 3,000 ng/L