利用双光子显微镜的艾滋病毒引起的神经炎症的小鼠模型脑血管结构的量化

摘要

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

摘要

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

引言

在病毒感染的急性期的人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的侵入脑，和生产性感染都小胶质细胞和脑定居巨噬细胞，导致它们的活化 - 并且两个来自宿主的炎症介质和可溶性HIV-1的释放virotoxins如Tat和gp120的（ ^在 1,2-综述）。因此，慢性神经炎状态成为中枢神经系统，这被认为是有助于HIV-1相关的神经认知障碍（手^），3-5的发病机制建立。

HIV-1的Tat或小鼠的中枢神经系统内白细胞介素（IL）-17A的慢性过度表达已被证明导致微血管稀疏^6,7。这就提出了慢性神经炎症可以通过对脑血管的影响造成的手发病的可能性。为了进一步探讨这个问题，我们已经制定的方法来量化脑血管STRUCTures的。

本文介绍的方法用于定量毛细管节点，毛细管段的数量，平均段长度，总段长度，平均毛细管直径，并通过一薄的颅骨皮质窗口使用毛细管网络的体内显像总毛细管体积（从先前描述的改性协议^）8,9，以及离体成像的脑切片中，使用双光子显微镜。这种组合方法提供用于脑血管的参数的整体定量，由于体内薄颅骨皮质窗口允许大脑保护环境，同时毛细管网络在脑切片的离体成像能够重建完整，立体毛细管网络 - 然后可以使用市售软件定量。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

罗切斯特大学委员会的动物资源学院批准在本文中进行的所有程序。

1.术前准备（和鼠标）

1. 所有必需的设备准备手术区。消毒预先用70％的乙醇的过程​​中使用的所有工具。或者，使用玻璃珠灭菌或高压灭菌消毒的工具。
2. 鼠标放置在异氟醚感应室，连接到一个异氟烷蒸发器。以1升/分钟的速率设置异氟烷水平至4％。
   注意:用强力霉素（DOX）诱导的HIV-1的Tat转基因的星形胶质细胞特异性胶质纤维蛋白（GFAP）启动子（HIV TAT-Tg小鼠）驱动此报告的实验中，小鼠¹⁰被用来检测艾滋病病毒的效果-1诱导的神经炎症对脑血管结构，如前所述^7,10。
3. 轻轻倾斜感应室，观察鼠标＃39; S翻正反射。一旦正位反射被抑制，异氟醚级别设置为2％和重定向从感应腔室到鼻锥的气流在手术台上。
4. 快速地从感应室向水注入加热垫移动鼠标。继续通过鼻锥申请异氟烷（1.5-2％）。根据个人老鼠容忍通过呼吸频率（RR）的监测评估，调整麻醉。
   注:RR的抑郁症可能扰乱生理气体参数改变脑血流量和血管直径评估。试图保持每分钟55-65次呼吸之间RR。心脏速率（HR）也可以用于评估麻醉深度;让HR每分钟300-450次之间，以防止生理改变血管直径。通常情况下，麻醉就足够了1.5-2.0％异氟烷之间以1L /分钟的一个给定的鼠标。
5. 执行脚趾捏进一步检查麻醉深度。如果鼠标不响应，通讯ENCE的外科手术。

2.制备薄头骨颅窗口

1. 应用人工泪液凝胶鼠标的眼睛。从用剪刀或电动剃须刀鼠标的头皮完全除去毛发。
2. 消毒头皮通过施加碘伏溶液;晾干。然后，在光学显微镜下，从小鼠的头皮去除皮肤，完全露出顶骨，尾椎额骨和前囟标记。
3. 为了干燥膜，便于拆卸应用少量的10％的氯化铁溶液到颅骨。与＃四十五分之五镊子轻轻刮了头骨中取出干燥的膜。
4. 围绕磁头板窗口涂抹一层薄薄的胶水。轻轻按压鼠标的头骨磁头板，保持感兴趣的区域，在窗口的中心。申请一滴牙科用粘固剂的给磁头板以聚合胶。
5. 涂抹薄薄的一层沿磁头板窗口的边缘胶以创建在其中容纳盐水的贮存器。一旦胶水已干，拧磁头板插入鼠标磁头板线束。
   注意:在此过程中使用的鼠标磁头板线束是与金属基体和两个金属柱的结构。在每列有一个弹簧和一个蝶形螺母。的磁头板被放置在弹簧的顶部，并蝶形螺母被拧紧，直到头部是水平和不移动。
6. 从使用连接到微扭矩钻头设定在6000转钻头的磁头板窗口除去任何胶。停止每10-15秒，以防止小鼠头盖骨的过热，可能导致对血管结构损坏。
   1. 使用新的钻头，横向放置微扭矩钻头1.5毫米从中线（三分之一磁头板窗口的直径）。开始薄这个位置周围的头骨在4000转。将钻头轻轻划过头骨没有直接的下行压力。
   2. 停火DRIL林志玲每隔10-15秒，以防止过热老鼠头盖骨。在此期间，利用压缩空气罐除去积累颅骨灰尘。
   3. 使用RT生理盐水滴冷却头盖骨5-10秒。轻轻地取出所有流体用柔软的纸巾，继续颅骨变薄。
7. 对于头骨的最终变薄，放置一个小体积的盐水中的磁头板容器和轻轻扫过牙齿microblade在感兴趣的区域，直到小血管都清晰可见。

3.监测生理指标

1. 一旦颅骨完全减薄，从保持器拆下小鼠，并将其放置在它的后面。轻轻大盘回落两个后腿清楚地暴露大腿内侧。
2. 取下发过来两个大腿内侧，用剪刀或电动剃须刀。由覆盖用碘伏大腿消毒手术部位。
3. 捏紧内侧右大腿上方的股静脉皮肤并采用动脉＃5镊子。轻轻拉动皮肤向上，用剪刀剪下，并去除皮肤。
   注:左大腿被保留在手术并发症（血管畸形，血管破裂）的事件。
4. 应用约3-5滴0.9％的盐水，以外科手术部位。这允许更大的放大血管，以及血管的保持湿润的部位，并防止干燥。通过解剖直言将用两个＃四十五分之五镊子股神经血管束分离动脉股静脉。
5. 放置两个，3厘米的片手术用缝合线的股动脉大约1cm相距下方。扭曲的缝线上顺时针创建血管止血带，这将有助于防止导管手术中失血过多。
6. 做一个小切口，用弹簧剪刀股动脉。放置导管中通过切口和预先动脉直到导管是牢固的动脉内。
解开上缝合（止血带），以评估是否有泄漏和正确的导管放置。通过把两个结用缝线容器内围绕导管固定在股动脉导管。
7. 注入10微升肝素（100IU / ml）的通过导管，以防止血液凝固。然后，通过用4-0缝合线在一个简单的断续图案一起缝制皮肤手术关闭右大腿。
8. 注入50μl的尿烷（1.2毫克/克）腹腔内插入右下腹。五分钟后用另一个将50μl注射到左下腹，共100微升腹腔氨酯重复。慢慢降低的异氟烷水平至约0.25％，而伴随地重新检查小鼠麻醉的深度。
   注意:使针浅沿后腹壁腹膜腔中，以使得它不穿孔肠道。这可以通过捏腹部腹直肌万亩完成scles远离内脏，然后注入。
9. 使用毛细管，收集动脉血从导管40微升样品。附加导管配备有生理盐水填充四通活栓和肝素灌封注射器的血压传感器。
10. 用胶带将血压换能器到手术装置，以防止意外取出导管。开始监视平均动脉压。
11. 插入血液填充毛细管成血液气体分析仪入口。一旦所有的血液已经被提取，从入口移除毛细管。在_O 2和CO ₂血气水平将出现在从血气分析仪打印纸。

4.注射荧光染料

1. 捏上使用＃5镊子内侧左大腿皮肤。轻轻拉动皮肤向上，用剪刀剪下，并去除皮肤。准备葡聚糖结合红色荧光染料罗丹明（70 kDa）的（10毫克/千克溶解在盐水中）。
2. 定位股骨vein.Using 1ml注射器附有一个地下30针，得出适当的用于成像到注射器的130微升线荧光染料的预先制备溶液。通过染料完全拉入注射器，坚决轻弹注射器墙上拔下所有气泡。
   1. 弯曲的地下30针在通过按下它来对一个硬表面斜角朝上的大约30度角。填补了染料的针并丢弃任何剩余液体，留下了100微升样品。
3. 染料的100微升样品注入慢慢进入股静脉。取出针后，应用稳定，轻轻压到注射部位，以制止任何出血。允许染料中循环5分钟。
   注意:可替换地，可以使用右股静脉，而不是用于荧光染料注射，以防止进一步失血通过创造另一种外科部位。此外，如果动物是从手术部位出血不受控制，这可能是一个表明太多肝素被给冲洗导管。如果在10-15分钟无凝结和鼠标还在流血，应考虑重新启动实验，一个新的鼠标。
4. 关闭左大腿用4-0缝合线缝合在一起的皮肤，然后小心地翻转鼠标到它的肚子，然后将其放入鼠标磁头板线束。

5. 体内双光子成像

1. 移动外科装置向双光子显微镜，确保连续保持麻醉的水平。放置一个小数量的0.9％盐水到磁头板容器和降低显微镜物镜，以便它进入与盐水接触。使用明收视目标定位感兴趣的领域
2. 设置双光子激光激发到适当的荧光染料的波长。使用25XØ开始双光子成像BJECTIVE。
   注意，在这些实验中，我们使用的缀合红色发光罗丹明染料被激发在780nm的波长的葡聚糖。甲三十六分之六百○七带通发射滤光片从染料检测荧光，以及一个带通二十零分之四百八发射器被用来检测动脉自发荧光
3. 找到一个毛细血管床查看屏幕上，并放大使用光学变焦2.采集利用双光子成像软件毛细血管的图像这一领域。
4. 成像完成后，通过颈脱位随后断头牺牲鼠标。

6. 离体双光子成像

1. 使用超等剪刀，使在头皮切口从interparietal骨骼鼠标的额骨。固定到皮肤用指针手指和拇指的头骨的侧面。
2. 将多余的精剪内侧interparietal骨下方切颅骨沿矢状​​缝。停割头颅约3mm后的前囟门标记。
   注:切割颅骨，以防止切割时，大脑应用上行压力。
3. 使用＃5镊子，从大脑中分离颅骨和小心从大脑的表面去除任何脑膜。剩余的脑膜可无意中划破大脑;极端应注意避免这种情况。轻轻滑动大脑慢慢前进着下＃5镊子，直到大脑不受头骨。
   注意:向下的压力，应使用以避免刺穿大脑。
4. 将大脑中的特定对小鼠脑切片工具。通过施加人工脑脊液滴在大脑洗大脑。
5. 从囟0除去大脑的2毫米冠状切面到前囟-2。放置冠状切面上含人工脑脊液与0前囟门凹陷载玻片（段大部分颅一部分）朝上。轻轻地覆盖在大脑SL冰，用玻璃盖玻片。
   注意:不要按一次放置在大脑部分，因为这可能会变形的血管结构的玻璃。
6. 幻灯片转移到显微镜台上，放置一个小数量的0.9％盐水盖玻片上。降低显微镜物镜，直到它与盐水接触。定位使用明目标脑的中线。
7. 开始双光子成像和定位中线使用25倍的目标了。通过寻找在冠状切面的皮质表面纵裂做到这一点。放置在中线成象屏幕的右边缘和移动查看器屏幕上横向3个完整的帧（约1.5毫米，从中线）。
   注意，在这些实验中，成像参数的那些相同，在步骤5.2中提到的音符。
8. 找到深度处的毛细血管都认为屏幕上几乎看不到。降低焦点的附加20的平面微米来确定Z堆叠的顶部。
9. 图像厚度设置为1微米。降低视图画面100微米，并调整激光功率在整个使得像素的小于1％的过饱和。
   注意:与z堆栈图像从一系列的连续100 500x500x1微米图像编译。所述的Z堆叠的更准确的后处理的计算会较大。通常，试图收集的z堆叠100微米或更大。
10. 按XY重复图标其次是相邻的XY图标。一旦Z堆栈完成后，按系列完成图标，保存文件。

7.数据处理

1. 在ImageJ的软件打开体内毛细血管的形象。手动设置基于从双光子软件获得的值的像素的距离的比率。
   1. 从工具菜单中的*直*图标。画从一个毛细血管壁延伸到OPPO线站点毛细血管壁，并记录由ImageJ的所提供的长度。
      需要注意的是，可能有必要对放大图像，以便清楚地显现毛细管壁的边缘。
   2. 在沿毛细管的不同位置重复步骤7.1.1，以及对多个毛细管的图像中。
2. 打开Z堆栈文件到分析软件，如阿米拉。选择从子应用程序工具栏中的灯丝编辑器图标
   1. 观察者厚度观察者设定为约20移动到顶部或在z堆栈底部。
   2. 选择跟踪图标，将光标移到加载的图像。上的毛细管在图2C描述的位置处的节点;段将相邻节点之间自动出现。毛细血管跟踪整个Z堆栈。
      注意:这将是必要把节点端点和分支点之间，以便跟踪毛细管THRoughout的z栈。
   3. 要删除这些节点，点击删除中间的图标。
      注意:此可以创建必须手动通过使用选择单图标选择循环，然后选择移除选定图标被移除错误环段。如果环路继续跟踪期间出现在同一地区，它是可能的节点被放置在不同的毛细管。
   4. 一旦跟踪完成后， 选择图形信息图标可打开包含自动提取血管参数的电子表格。可用的主视图屏幕上节点和段的数量。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

薄颅骨皮质窗口允许用于体内双光子皮质毛细血管成像（ 图1）。合适的区域，图像显示众多的，不同的毛细血管（ 图1A）。在同一视场，不存在动脉细胞壁自发荧光，以及可能还有其他的荧光信号，如胶原荧光，诱发二次谐波生成^11（图1B）。

一旦脑切片的准备已完成，摄...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

此处所描述的方法可用于分析脑微血管结构在大范围的实验模型/设置。对于这种方法的成功，有三个关键步骤，必须要掌握。首先，将薄颅骨窗不能损伤颅骨或底层大脑。这是很容易变薄时穿破头骨，或引起热诱导的血管渗漏。这可以通过摄像干扰作为荧光染料将泄漏到焦点的平面中，并掩盖了毛细血管。如果颅骨薄头骨制备过程中频频打破，它很可能是过大的下行压力造成的。握住微扭矩钻尽...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica Microscope	Leica Inc.	MZ8
High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner	180
Heating Pad	Stryker	TP3E
T/PUMP	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer	Datex Ohmeda	447
Artificial Tear Gel	Butler AHS	7312
Povidone-Iodine solution	Aplicare	52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Ferric Chloride Solution	Ricca Chemical Company	3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel	Henkel	45404
Dental Cement	Stoelting	51459
Microtoruqe II Handpiece Kit	Pearson Dental	R14-0002
005 Burr for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05
Norland Blade (Dental Microblade)	Salvin Dental	6900
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Group 2B Carcinogen
Braided Suture	Ethicon	735G
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Arterial Catheter	SAI Infusion Technologies	MAC-01	The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.
Blood Pressure Moniter	World Precision Intruments	SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable	World Precision Intruments	BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer	Siemens	248
40 μl Capillary Tube	VWR	15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)	Invitrogen	D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Spectra-Physics
ImageJ Software	National Institutes of Health (NIH)		Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software	Visage Imaging