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摘要

在这里，我们描述了该朝向为下游应用和进一步分化的改善的定形内胚层致力于分化的人类胚胎干细胞的纯化方法。

摘要

多能干细胞，如胚胎干细胞（ESC）的分化能力允许对细胞替代疗法的潜在的治疗应用。终末分化的细胞类型可以用于各种退行性疾病的治疗。 在体外 ，这些细胞向肺，肝脏和胰腺的组织的分化需要作为第一步定型内胚层细胞的产生。这个步骤是限速为朝向末端成熟细胞类型，如产生胰岛素的β细胞，肝细胞或其它内胚层来源的细胞类型进一步分化。即朝向内胚层谱系定型细胞高度表达的转录因子如FOXA2，SOX17，HNF1B，该GATA家族的成员，且表面受体CXCR4多种。然而，分化的协议很少是100％的效率。这里，我们描述了一种用于一CXCR4阳性细胞群的分化后的纯化入DE通过使用磁微珠。这种净化此外删除不需要的谱系的细胞。平缓的纯化方法是快速，可靠的，并且可以用于改善下游应用和分化。

引言

多能干细胞，如胚胎干细胞（ESC）具有分化成几乎人体的任何细胞类型的能力。因此， 在体外分化协议可以被用于产生许多成人细胞类型，如心肌1，肝细胞2，β细胞3，肺上皮4或神经元细胞5。这使得胚胎干细胞对各种退行性疾病3的潜在治疗的有价值的工具。

胚胎干细胞的朝向肺，肝脏和胰腺的成人组织中体外分化需要一个伪原肠胚成让人想起定形内胚层（DE）6的细胞。因为向上述体细胞类型的下游分化是显著效率较低，最佳的内胚层分化被视为限速7。被朝内胚层系致力于细胞进行查在他们的基因表达谱racteristic变化。多能性主控调节基因被下调，而其他转录因子如FOXA2，SOX17，HNF1B，该GATA家族的成员和表面受体CXCR4被高度上调6，8，9。CXCR4已知由SMAD2被反式表达/ 3，交点/ TGF-β信号传导和SOX17的下游，由于在其启动子区域10特异性结合位点。因此，它是在一些报告6,8 11-13中使用的非常合适的标记。这些表达的变化反映了伪原肠事件，其中胚胎干细胞首先获取原始的条纹状的细胞群的特点，并随后提交到内胚层胚层6。

然而，分化的协议很少是100％有效，因为一些细胞可能会抵制分化过程或向其他意外谱系分化14。这些细胞可能负面influeNCE进一步分化。此外，剩余的未分化细胞海港供以后移植实验很大的风险，并可能导致畸胎瘤15-17。

除去这些不想要的细胞早期的表面标记物CXCR4的可用于该朝向DE 18致力于细胞的纯化。在这里，我们描述了从DE分化培养物的CXCR4 +细胞的阳性选择的方法。对于这一点，表面标志物CXCR4的是由再依次结合至磁微珠的抗体结合。不像FACS分选过程中的恶劣条件下，磁性标记DE样细胞然后可以很容易地在一个台式格式使用温和的纯化方法进行纯化。这个协议提供了用于抵制对DE分化过程中除去细胞群的一个简单的方法。

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研究方案

1.人类ESC分化对定形内胚层

  1. 培养在培养箱中的人胚胎干细胞（ESC），在37℃和5％ 的 CO 2。
  2. 涂覆新的6孔细胞培养板用1ml基底膜基质孵育培养餐具在RT至少30分钟。有关具体细节，请谈谈各自制造商的说明。
  3. 确认该培养的人胚胎干细胞已达到使用低倍率（ 例如，4X）在显微镜下的80％-90％汇合。吸通过吸走培养基，用无菌玻璃巴斯德吸管从空腔的介质。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液洗涤细胞一次。对于这一点，加入2毫升的PBS至每孔轻轻摇动板和吸出溶液，以去除死细胞和细胞碎片。
  4. 加入1毫升的无酶传代解决方案，试剂的细胞团的解离温柔。在37℃的细胞D 5％的CO 2，直到细胞显示中断的迹象明显分成小簇。
    注:培养时间取决于所使用的试剂。在材料部分中提到的无酶传代溶液，温育时间大约是7分钟。
  5. 加入1ml的DMEM / F-12培养基并通过上下抽吸用1毫升枪头破坏剩余的细胞聚集成单个细胞。使用此冲洗从表面的细胞和细胞转移到一个离心管中。检索所有细胞，用1ml的DMEM / F-12培养基中洗每个孔，并在介质加入到离心管中。
  6. 离心细胞5分钟，在300×g的。吸出上清液并重新悬浮于5毫升的ES细胞培养基含有10μM的Rho激酶（ROCK）抑制剂的细胞。
  7. 算使用血球在显微镜下的细胞和种子150000 - 400,000个单元格每6孔或在另一块板的布局，这取决于所用的胚胎干细胞系。使用CULTURE培养基含有10μM的ROCK抑制剂，以避免细胞凋亡和培养在培养箱中的细胞在37℃和5％的CO 2。
  8. 大约24小时后播种抽吸介质用无菌玻璃巴斯德吸管，并加2ml原条诱导培养基中。
    注意:此培养基含有高级RPMI-1640培养基1％谷氨酰胺，0.2％FCS，5μMCHIR-99021和50ng / ml激活素A的最终浓度。通常，使用两毫升培养基用于培养在6孔平板上。
  9. 接种后48小时，更换为内胚层诱导培养基的媒介。培养细胞的另一个48小时，每天更换培养基这个网上平台。
    注意:此培养基含有高级RPMI-1640培养基1％谷氨酰胺，0.2％FCS和50ng / ml激活素A。正在朝着定型内胚层致力于细胞表达表面标志CXCR4。 CXCR4的染色可以用于量化的DE-致力于细胞的数目。
2。 CXCR4 +定形内胚层细胞的染色流式细胞仪分析

  1. 收获前的最后24小时，但至少1小时的细胞中添加10μMROCK抑制剂的培养基。
  2. 涂层的细胞培养器皿，将用于重新播种与基底膜基质， 即用于免疫荧光染色定量PCR分析或室载玻片12孔板。孵育所述板或幻灯片在室温至少30分钟。
  3. 吸与用于染色和/或分选的分化的细胞的孔中的无菌玻璃巴斯德吸管的介质。
  4. 加入1ml无酶传代溶液试剂为细胞团的温和解离。孵育细胞在37℃和5％的CO 2，直至细胞显示中断的明显迹象成小簇。
    注:培养时间取决于所使用的试剂。在马泰提到的无酶传代溶液ALS部，温育时间大约是7分钟。
  5. 加入1ml的DMEM / F-12培养基并破坏通过上下吹打使用1毫升尖剩余细胞聚集成单个细胞。使用此冲洗从表面的细胞和细胞转移到一个离心管中。检索所有细胞，用1ml的DMEM / F-12培养基中的w / o FCS洗每个孔，并在介质加入到离心管中。
  6. 算使用血球在显微镜下的细胞。从6孔板的三个孔细胞应后分化三天导致10-15×10 6个细胞。离心细胞5分钟，在300×g的。
    注意:得到的细胞的确切数目将取决于用于分化多能干细胞系。
  7. 吸出上清液并重新悬浮在含有10μM的ROCK抑制剂PEB缓冲器细胞。使用100微升该缓冲液中达10 7个细胞。添加10μM的ROCK抑制剂上staini的天NG。使用该缓冲液用于所有下游应用（被称为PEB缓冲液+ RI）。
    注:PEB缓冲液含有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS中。如果有更多的细胞被染色，相应地调整缓冲体积。
  8. 每10 7个细胞加入10微升CXCR4-APC抗体对100微升，这大致表示1:10的稀释度。
    注意:一个APC连接的抗体的使用不是强制的。相反，它可以根据所用的微珠被取代。如果有更多的细胞被染色相应地调节抗体量。
  9. 通过用手指轻轻翻转管混合并在冰箱中在4℃孵育15分钟。重悬以1-2毫升PEB缓冲器细胞。离心细胞5分钟，在300×g的。
  10. 吸用无菌玻璃巴斯德吸管将上清液和重悬细胞沉淀在每10 7个细胞80微升的PEB，并添加20微升抗APC微珠。
    注意: 如果更多的细胞是被染色，相应地调整微珠体积。
  11. 通过用手指轻轻翻转管混合并在冰箱中在4℃孵育15分钟。重悬以1-2毫升PEB缓冲液+ RI细胞。离心细胞5分钟，在300×g的。吸出缓冲器。悬浮于500μlPEB缓冲区+ RI。

3. CXCR4 +细胞磁选

  1. 放置在磁场中的中等大小的磁列按照制造指令。预冲洗用500μlPEB缓冲区+ RI列。申请的全部细胞悬浮液上柱。收集通过，因为不是所有细胞中的流动将与柱结合。确保不打扰列CXCR4 +细胞的最佳检索。
  2. 洗柱用500μlPEB缓冲+ RI三次。通过收集第一流动并与收集的细胞来自步骤3.1相结合。从磁场去除磁列，并将其放置在一个合适的收集管。加入1ml PEB缓冲+ RI在柱子上。为了洗脱细胞柱塞用力按下到列中。
  3. 可选的:分别收集通过样品的所有流动和使用各20微升分析使用流式细胞仪的CXCR4 +细胞的数目。其数量应与每个洗涤步骤下降。
    注:在至少2×10 4个活，门控细胞应该算为可靠的结果。
  4. 重复步骤3.1-3.3从3.1步收集流过样品，并通过使用样品新列第一，由步3.2。不要重复使用前一列。通过使用柱塞空气被压入柱，其阻断它。
  5. 算使用血球在显微镜下的细胞。根据不同的分化达6×10 6个细胞的效率可以最初排序和另一个1×10 6个细胞使用10 7个细胞的过程时使用的第二列。
  6. 离心细胞，在300×g离心5分钟。吸出上清液，用无菌玻璃巴斯德吸管和来自步骤1.9与附加10μM的ROCK抑制剂悬浮在1ml内胚层的诱导培养基中的细胞。
  7. 算使用血球在显微镜下的细胞。种子的细胞以合适的密度， 即，〜4×10 5个细胞每一个12孔板的孔（表观3.6 cm 2的表面）或者〜每8孔腔室载玻片孔1.5×10 5个细胞。

4.可选:纯净定形内胚层人口分析

  1. 对于免疫荧光染色固定来自步骤3.7纯化的细胞大致与4％多聚甲醛和染色为定形内胚层（DE）和/或多能性标记蛋白接种后24小时。
    注:常用的DE标志物包括FOXA2和SOX17，常用的多能性标志物包括OCT3 / 4，NANOG和SOX2 6,8。
  2. 佛- [R RT-qPCR的分析，收获纯化细胞直接或24小时后播种，提取总-RNA和反向从提取的总-RNA样品的cDNA转录。使用10纳克的cDNA作为每RT-qPCR的反应（一式三份）模板来分析DE和多能性标记基因6,8的表达。
    注:常用的标记基因在步骤4.1提及。循环条件是95℃5分钟，并在95℃15秒的40个循环，在60℃1分钟，接着通过熔化曲线分析。

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结果

在分化时 胚胎干细胞进行基因和蛋白质表达的急剧变化。 图1描绘了可用于验证成功定形内胚层分化典型的标记基因。对于基因表达分析的主要目标是GSC，FOXA2和 SOX17在一个相对的基因表达分析尤其是FOXA2和SOX17相比未分化的胚胎干细胞时，增加了> 2000倍。GSC原条的形成过程中已经表示24小时内很早但它仍?...

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讨论

目前使用的分化协议很少导致100％的分化的细胞。对于仍然有要解决的原因，某些细胞抗蚀分化过程。取决于所用的分化方案的效率和ESC的倾向排队甚至分化成定形内胚层后，通常观察到残余的多能细胞的一定数量。这些残余细胞会削弱下游分化或进一步的分析，如转录组学，蛋白质组学和miRNA表达分析。残留的多能干细胞或其它不想要的谱系也可以表现出可与分化目标干扰旁分泌的影响。因此?...

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披露声明

The authors declare that they have no competing financial interests.

致谢

茉莉Kresse的熟练技术援助深表感谢。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Hues8 human embryonic stem cell lineHarvard Department of stem cell & regenerative biologySuitable cell line for endoderm generation
Hes3 human embryonic stem cell lineES Cell InternationalSuitable and robust cell line for endoderm generation
mTeSR1Stemcell Technologies5850ESC culture medium
FCSBiowestS1860
Advanced RPMI 1640Life Technologies12633012
CD184 (CXCR4)-APC, humanMiltenyi Biotec130-098-357
anti-APC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-090-855 
OctoMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-109magnetic field
Y-27632Selleck ChemicalsS1049ROCK inhibitor
CHIR-99021Tocris Bioscience4423
Activin APeprotech120-14
Gentle Cell Dissociation ReagentStemcell Technologies7174Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA
Matrigel*Corning354277basement membrane matrix
* solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12.
Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature.
Remove the matrigel and use immediately.
MS ColumnsMiltenyi Biotec30-042-201
MACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
Human FOXA2 FW
gggagcggtgaagatgga		Life TechnologiesNA
Human FOXA2 REV
tcatgttgctcacggaggagta		Life Technologies
Human GSC FW
gaggagaaagtggaggtctggtt		Life Technologies
Human GSC REV
ctctgatgaggaccgcttctg		Life Technologies
SOX17 TaqMan assayApplied BiosystemsHs00751752_s1
Human SOX7 FW
gatgctgggaaagtcgtggaagg		Life Technologies
Human SOX7 REV
tgcgcggccggtacttgtag		Life Technologies
Human POU5F1 FW
cttgctgcagaagtgggtggagg		Life Technologies
Human POU5F1 REV
ctgcagtgtgggtttcgggca		Life Technologies
Human Nanog FW
ccgagggcagacatcatcc		Life Technologies
Human Nanog REV
ccatccactgccacatcttct		Life Technologies
Human TBP FW
caa cag cct gcc acc tta cgc tc		Life Technologies
Human TBP REV
agg ctg tgg ggt cag tcc agt g		Life Technologies
Human TUBA1A FW
ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c		Life Technologies
Human TUBA1A REV
tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g		Life Technologies
Human G6PD FW
agg ccg tca cca aga aca ttc a		Life Technologies
Human G6PD REV
cga tga tgc ggt tcc agc cta t 		Life Technologies
Anti-SOX2Santa Cruz Biotechnologysc-17320
Anti-FOXA2MerckMillipore07-633
Anti-SOX17R&D SystemsAF1924

参考文献

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